ESB riconosce finanziamento da Innovator Award nuovo direttore NIH (DP2 OD002002-01), NIH sovvenzione sfida 1RC1MH088182-01, NIH Grande opportunità di Grant 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, NSF (0.835.878 e 0.848.804), il McGovern Institute Award Program Neurotechnology , il Dipartimento della Difesa, NARSAD, l&#39;Alfred P. Sloan Foundation, Jerry e Marge Burnett, il Premio per l&#39;Innovazione SFN Ricerca in Neuroscienze, il MIT Media Lab, la Fondazione Benesse, e il Wallace H. Coulter Foundation.

1. Costruire Morsetto Stereotassica <ol><li> Il morsetto stereotassica viene utilizzato per collegare l&#39;array iniettore al stereotax, in modo che gli iniettori sono parallele al braccio stereotassica. </li><li> Ogni laboratorio ha bisogno di un solo morsetto, a meno che non si prevede che più di un intervento chirurgico può avvenire contemporaneamente. In questo caso, fanno lo stesso numero il numero massimo previsto di interventi simultanei. Potrebbe anche essere consigliabile fare un ulteriore, in caso di danni al primo. </li><li> Per rendere il morsetto stereotassica, in primo luogo, un diametro 1,5 mm esterno (OD) in acciaio cannula viene tagliata a 2 cm di lunghezza, e una delle estremità è Dremeled verso il basso fino piatto. </li><li> Poi, un piccolo pezzo (circa 0,5 x 0,5 cm) è tagliato fuori PCB proto-board, da utilizzare come un distanziatore. </li><li> Utilizzando un cutter laser per garantire che eventuali riduzioni effettuate sono perpendicolari alla superficie del materiale, due rettangoli uguali (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) sono tagliati da 1 / 8 &quot;fogli di acrilico, ogni rettangolo con due fori circolari in angoli opposti del rettangolo. La prima buca ha un diametro 1,5 mm, ed è solo abbastanza grande da contenere la cannula metallica ermeticamente. Il secondo foro ha diametro 1 / 16 &quot;(Figura 1C). </li><li> La cannula in metallo è inserito nel foro 1,5 mm di un rettangolo, poi attraverso il foro di 1,5 mm di secondo. L&#39;estremità inferiore della cannula è allineato con la faccia inferiore del rettangolo in basso, formando la forma di un bastone da hockey. </li><li> Pur mantenendo il distanziatore saldamente tenuto tra i due rettangoli, questa struttura è cementata insieme utilizzando colla a caldo intorno ai fori cannula e 1,5 mm, facendo attenzione ad evitare di incollare le distanziatore per i rettangoli. Plastilina può essere utile a tenere insieme le cose durante questo processo. </li><li> Dopo che la colla si è asciugata, un 1-72 vite è inserito nel 1 / 16 buche dal lato superiore dei rettangoli. Poi un 1-72 dado esagonale che si avvita sulla fine della vite 1-72, e serrati. La vite e il dado servono a tenere insieme il morsetto. </li><li> Per collegare il dado esagonale per la faccia inferiore del rettangolo in basso, piccole quantità di 5 minuti a resina epossidica sono sceso intorno al bordo del dado esagonale, senza permettere la resina epossidica per ottenere nei filetti del dado esagonale o vite. Qualsiasi plastilina viene rimosso e si conferma che il distanziatore può essere tenuto saldamente stringendo la vite. </li></ol> 2. Preparazione del sistema per l&#39;array personalizzati iniettore: Hamilton pompa e stereotax <ol><li> Il sistema array iniettore può essere personalizzato per qualsiasi serie di coordinate nel cervello. </li><li> Il primo utente individua le coordinate dei siti di iniezione desiderato in un mouse (o altre specie) atlante del cervello, la conversione in coordinate appropriato utilizzato dal stereotax (qui, X, Y e Z-coordinate). Il numero di siti di iniezione (tre in Figure 1A e 1B) sarà d&#39;ora in poi essere chiamato k. </li><li> k numero di siringhe da 10 microlitri Hamilton si trovano in una iniezione / prelievo pompa a siringa come questo da apparecchi di Harvard. </li><li> Prossimo, 3-piede-lungo pezzi di tubo in polietilene sono saldamente collegato al l&#39;ago della siringa ogni Hamilton. </li><li> Per ogni pezzo di tubo in polietilene, un F-252 manicotto tubo dal Upchurch scientifico è scivolato sopra l&#39;estremità aperta e collegata ad un P-627 adattatore di tubi utilizzando il dado inclusa e puntale, anche da Upchurch scientifico. </li></ol> 3. Costruire la matrice su misura Injector <ol><li> Ogni array iniettore è personalizzato per l&#39;insieme di coordinate che l&#39;utente sceglie. Tuttavia, per i set di coordinate che differiscono solo per uno / o di traduzione e di rotazione, l&#39;array stesso iniettore può essere utilizzato. </li><li> Considerando solo le coordinate X e Y relativo dei siti di iniezione, fori k sono perforati in un PCB proto-board di spessore 1 / 32 &quot;, con la stessa spaziatura relativo. Questi fori sono realizzati utilizzando un mulino e un mini Modela 0,011&quot; Diametro punta da trapano da McMaster-Carr. Assicurarsi di utilizzare una bassa velocità di foratura (Z-velocità) per evitare di rompere o usura la punta del trapano. Prima di rimuovere la scheda dal mulino, un rettangolo è forato intorno i piccoli fori, con una punta più grande del diametro 1 / 32 &quot;, per evitare di indossare il più piccolo codice per il mulino mini possono essere generati facilmente utilizzando MATLAB;. Campione codice viene fornito nei seguenti file. <ol class="lroman"><li> generate.m - codice MATLAB per la generazione di codice Modela dalle coordinate desiderato </li><li> holes_ex.rml - codice Modela per suoneria foratura (otto buche) in Proto-board </li><li> outline_ex.rml - codice Modela per rettangolo intorno ai fori di trivellazione </li></ol></li><li> 245 micron OD/100 micron diametro interno (ID) tubi capillare di silice fusa, disponibile da Technologies Polymicro, è tagliato in numero k di 3 pezzi pollici. Questi comprendono gli iniettori singoli. Un pezzo di tubo capillare monouso è colpito conciascuno dei fori, per eliminare i detriti senza intasare gli iniettori reale. Gli iniettori sono poi inseriti a metà strada in ogni foro, in modo che si tengono strettamente e parallele l&#39;una all&#39;altra. Gli iniettori sono incollate alla tavola, che formano la struttura dell&#39;array iniettore. Tutto ciò che rimane è quella di tagliare gli iniettori alla lunghezza corretta. </li><li> L&#39;array iniettore è collegato al morsetto stereotassica mettendo un angolo del proto-board tra i rettangoli acrilico, e poi stringendo la vite del morsetto stereotassica. Successivamente, la cannula metallica del morsetto è collegato al stereotax, utilizzando il meccanismo di fissaggio del stereotax. </li><li> Tutti i seguenti è fatta sotto un microscopio. Per uno degli iniettori esterno (che è, uno che può essere affrontato dal lato con un regolo, senza sbattere contro nessuna delle altri iniettori), la punta si estende oltre la parte inferiore del proto-board è tagliato con le forbici. Per preparazioni iniettabili corticale, è opportuno avere l&#39;iniettore una estensione di circa 5 millimetri al di là della superficie del proto-board. Per i più iniezioni, questo numero può essere aumentato dal corrispondente aumento in profondità. La punta è appiattito con un utensile Dremel. Suggerimenti iniettore può essere anche terra in un angolo come ulteriore precauzione contro l&#39;intasamento, se la precisione in profondità è meno importante. </li><li> Poi, un punto di riferimento stabile viene scelto all&#39;interno del raggio del braccio stereotassica, e l&#39;array iniettore viene spostato in modo che la punta appiattita del iniettore esterno, è a questo punto di riferimento. </li><li> Un secondo iniettore è scelto, insieme con le sue coordinate corrispondenti. Considerato è la differenza relativa in altezza (direzione z) tra le coordinate primo e il secondo iniettore. L&#39;array iniettore è spostato lungo l&#39;asse Z da questa distanza relativa. L&#39;iniettore secondo è tagliato e Dremeled alla lunghezza corretta, in modo che la punta di un iniettore secondo è ora piatta e all&#39;altezza del punto di riferimento. L&#39;array iniettore può essere spostato in direzione X e Y per facilitare il confronto della punta iniettore con il punto di riferimento. </li><li> Questo processo di taglio viene ripetuto per gli iniettori rimanenti. </li></ol> 4. Assemblare l&#39;intero sistema <ol><li> Il morsetto stereotassica e personalizzati serie iniettore, entrambi già costruiti, sono necessari per questa parte. </li><li> Il back-end di ogni iniettore (alla fine che non è stato tagliato) viene inserito in un blu di F-240 manica tubi e, usando un dado P-235 e P-200 puntale da Upchurch scientifico, è collegato all&#39;adattatore filettato già collegato alla pompa Hamilton da tubi in polietilene. Le istruzioni del produttore è consultabile per i dettagli. </li><li> Usando una 27-gauge, olio di silicone viene iniettato nella parte posteriore delle siringhe Hamilton in modo che l&#39;intero sistema viene riempito dalla siringa Hamilton alla punta iniettore, senza bolle d&#39;aria a tutti. </li><li> Come le siringhe Hamilton sono ri-collocati in pompa di Hamilton, il volume massimo possibile di olio di silicone viene mantenuta in siringhe. </li><li> Se l&#39;esperimento richiede più siringhe che la pompa è progettata per (due in questo caso), le siringhe possono essere distanziati con piccoli pezzi di plastica (per esempio, tappi ago) per tenerli paralleli l&#39;uno all&#39;altro, e per garantire che tutti i pezzi sono spinto dalla pompa nella stessa misura. O, un multi-rack kit di aggiornamento possono essere acquistati presso Apparato Harvard per contenere fino a 10 siringhe in una volta. </li></ol> 5. Iniezioni / chirurgia <ol><li> Il processo di iniezione con un parallelo iniettore è molto simile a quella di iniettare con una pipetta singola. </li><li> E &#39;indispensabile l&#39;utilizzo di ricarica lenta / tassi di infondere in tutto questo processo, perché veloce pompaggio potrebbero stressare la giunzione tra tubi grandi e piccoli. Consigliato rate massimo: 2 microlitri / min per il caricamento del virus, e 0,1 microlitri / min per infusione di virus. </li><li> Un mouse anestetizzato si trova nel stereotax, e resta anestetizzato per tutto l&#39;esperimento. </li><li> Preparare il mouse, se necessario. Ad esempio, con un bisturi, un unico taglio è fatto lungo la linea mediana della pelle, da in mezzo agli occhi di tra le orecchie. La pelle è tirata indietro per esporre il cranio, e la fascia è rimosso. Una pipetta di vetro tirato è collegato al stereotax. Le posizioni delle barre dell&#39;orecchio sono regolati fino bregma e lambda sono allineati alla stessa altezza, e in modo che la linea che li collega è parallela l&#39;asse Y del stereotax. Gli assi del stereotax sono orientati secondo il sistema di coordinate in cui le coordinate di iniezione sono stati calcolati. Il stereotassica viene azzerato con la punta della pipetta di vetro a bregma, poi la punta è posizionata leggermente sopra il cranio al X e Y le coordinate di uno dei siti di iniezione. </li><li> Utilizzando un trapano dentistico, il teschio sotto la punta è attentamente confrontato via fino a quando rimane uno strato estremamente sottile di tessuto osseo. La pipetta di vetro può essere inferioreed e cresciuto a verificare che il foro è perforato è centrato nella posizione corretta. Usando un 30-gauge, un piccolo pezzo di livello è leggermente raccolti al largo, al corretto X e Y-coordinate, in modo che la dura madre è esposta. Questo buco dovrebbe essere solo grande abbastanza da contenere una delle iniettori (0,25 mm di larghezza). Vedi Figura 1D per diagramma. In questo modo, i piccoli, fori 0,25 millimetri sono fatte largo nel cranio, al X e Y coordinate corrispondenti a ciascun sito di iniezione. </li><li> La pipetta di vetro viene scartato in un apposito contenitore, e l&#39;array personalizzati iniettore è collegato al stereotax utilizzando il morsetto stereotassica. </li><li> Al fine di impostare correttamente l&#39;angolo del vettore iniettore, due iniettori esterni sono scelti per essere calibrato a un punto di riferimento, come segue. Dopo uno degli iniettori è abbinato con il punto di riferimento, si consideri la relativa X e Y distanze tra i siti di iniezione iniettore rispetto a questo e altro. Gli assi del stereotax sono regolate in modo che tutta la serie iniettore viene spostata nel X e Y direzioni da questi distanze relative. Se l&#39;iniettore seconda non è ora allineato con il punto di riferimento, la cannula metallica è allentato e ruotato. Questo processo viene ripetuto iterativamente fino a quando l&#39;array iniettore è angolato in modo corretto. </li><li> Prima di riempire gli iniettori con il virus, gli iniettori sono pieni di olio di silicone fino a quando le siringhe sono al punto 2 microlitri (o superiore). Ciò fornisce una zona cuscinetto, in modo che eventuali bolle d&#39;aria o di intasamento nella punta può essere facilmente rimosso spingendo in avanti con l&#39;olio della pompa di Hamilton, senza dover ricaricare l&#39;intero sistema con olio di silicone dal retro delle siringhe, come descritto in precedenza. </li><li> Un pezzo di Parafilm sterile è posto sul cranio, e gli iniettori sono leggermente abbassati sui Parafilm. Per le coordinate con profondità molto diverse, una custom-fresato parte (ad esempio un oggetto a forma di scala) potrebbe facilitare il caricamento. </li><li> Le parti che seguono presuppongono che 1 ml di virus per essere caricato in ogni sito (le seguenti quantità dovrebbe essere ridimensionato se piccole quantità sono desiderati). Al fine di garantire che&gt; 1 ml di virus viene iniettata in ogni sito, 1,5 ml di virus è pipettato sul Parafilm o scale in punta di ciascun iniettore. </li><li> Con il tasso di riempimento della pompa Hamilton set a 1 microlitri / min, 1,2 ml di virus è riempito in ogni iniettore. </li><li> La punta più lunga l&#39;iniettore è azzerato al bregma, e poi l&#39;array iniettore è spostata a X e Y coordinate di tale iniettore. Se l&#39;intasamento è un problema, dire se molti obiettivi in ​​profondità sono coinvolti: anche prima di inserire i suggerimenti iniettore nel cervello, a volte è consigliabile iniziare l&#39;infusione di pompa, fino a virus può essere visto emergere da tutte le iniettore punte. Ciò elimina le bolle d&#39;aria alle estremità iniettore, e inoltre assicura che non c&#39;è intasamento. Nel caso di intasamento, la pompa Hamilton è impostato per infondere un breve impulso ad una velocità superiore di 2 microlitri / min, per eliminare delicatamente intasamento. </li><li> L&#39;array iniettore è poi abbassato, attraverso i piccoli fori fatti con i 30-gauge aghi, per la corretta profondità Z. </li><li> 1 ml di virus viene iniettato attraverso ogni iniettore, a 0,1 microlitri / min. </li><li> Le iniezioni sono lasciati soli per 30 minuti. </li><li> Dopo l&#39;array iniettore sta lentamente estratte dal cervello, la pompa Hamilton è impostato per infondere allo stesso tasso di 0,1 microlitri / min, al fine di verificare la presenza di ostruzioni in ogni iniettore. </li><li> Allora gli iniettori sono puliti da ricarica e infondendo 1,5 ml di etanolo a 2 microlitri / min. </li><li> Infine, gli iniettori sono riempiti con olio di silicone per mantenere la zona 2 microlitri di buffer in ogni siringa Hamilton. </li><li> Tutte le attrezzature devono essere sterilizzati prima e dopo la procedura, in base alla biosicurezza del vostro istituto e protocolli di utilizzo. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati L&#39;array parallelo iniettore accelera un intervento chirurgico o meno di un fattore pari al numero di iniettori, senza contare l&#39;installazione e il tempo di recupero, anche se i tempi individuali dipenderà dalla capacità del praticante. Per una iniezione 1 microlitro, di solito visto l&#39;espressione lentivirus in una sfera di diametro di circa 1 mm (Fig. 1E). La precisione dell&#39;iniezione era tale che la variabilità nel posizionamento punta, da prova a prova, era di circa 45 micron (deviazione standard della distanza dalla posizione di punta nella posizione di punta previsto). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Progettazione, implementazione e utilizzo di un array parallelo virus iniettore. A, schematica del parallelo sistema array iniettore, che mostra una configurazione tripla iniettore, per tre iniezioni simultanee. B, la fotografia di una triplice serie parallela iniettore come diagramma in A . <strong&gt; C, morsetto stereotassica, mostrato a grandi linee dall&#39;alto D, illustrazione della tecnica per una efficiente, riducendo al minimo i danni-, apertura di fori nel cranio per iniettore inserimento nel cervello:. con un trapano dentistico, il cranio sottile spessore fino a circa 50 micron, quindi utilizzare la punta di un ago affilato per aprire una piccola craniotomia. E, immagine che mostra fluorescenza channelrhodopsin-2 (ChR2)-GFP-etichettata cellule in tre regioni corticali del mouse, come bersaglio l&#39;array triplo iniettore mostrato in B.

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	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

Tutte le procedure erano in conformità con la Guida NIH per gli animali da laboratorio e approvato dal Animal Care MIT e Usa e Comitati biosicurezza.

Negli ultimi anni, un certo numero di sensibilizzatori ottici geneticamente codificato neuroni hanno permesso di essere attivato e messo a tacere in vivo in un preciso temporalmente-moda, in risposta a brevi impulsi di luce (ad esempio, 1,4,5,6,7,8 , 11). Un metodo chiave con cui i neuroni sono stati sensibilizzati alla luce nel cervello dei mammiferi, avviene tramite virus come lentivirus e virus adeno-associati (AAV), che può fornire geni che codificano per opsine al cervello di animali che vanno dai topi alle scimmie, in un modo sicuro e duraturo (ad esempio, 2,9,10). I virus permettono tempi di risposta più veloci di quanto non facciano transgenici, soprattutto per gli organismi che non sono organismi modello genetico, come ratti e scimmie, e per opsine può consentire alti livelli di espressione che non può essere possibile in scenari transgenici. Qui mostriamo una serie parallela iniettore in grado di creare, in tempi rapidi, &quot;a livello di circuito transgenici&quot;, consentendo l&#39;intero 3-dimensionale strutture cerebrali per essere virale mirati con un gene, in un unico passaggio chirurgico. L&#39;array iniettore comprende una o più pompe che ogni unità di una serie di siringhe, ognuna delle quali si inserisce in un poliammide / capillare in silice fusa mediante un alta pressione-tolerant connettore. I capillari sono dimensionati, e quindi inserito in, posizioni desiderate specificato da custom-fresatura una scheda stereotassica posizionamento, permettendo virus o altri reagenti da consegnare il set desiderato di regioni del cervello. Per usare il dispositivo, il chirurgo prima riempie il sottosistema fluidico interamente con olio, backfills i capillari con il virus, inserisce il dispositivo nel cervello, e infonde reagenti lentamente (&lt;0,1 microlitri / min). Questa tecnologia consentirà una vasta gamma di nuovi tipi di esperimenti, come millisecondo-temporale chiusura di strutture a forma complessa (come ad esempio l&#39;ippocampo) in momenti precisi durante il comportamento, l&#39;inattivazione temporalmente precisa di strutture bilaterali che possono agire in modo ridondante (come a sinistra ea destra amigdala), e la perturbazione di molteplici regioni cerebrali distinti (per esempio, guidare due regioni collegati fuori fase per studiare come cross-regione sincronia dipende attività all&#39;interno di ogni regione, o stimolanti input per una regione, mentre a tacere un sottoinsieme di gli obiettivi al fine di capire quale dei diversi obiettivi sono fondamentali per mediare gli effetti di tali ingressi). Al posto del cervello di grandi dimensioni come quelli del primate, in cui abbiamo recentemente dimostrato ottica delle cellule di tipo specifico di attivazione neurale 3, conturbante attività in una comportamentale rilevante per zona può richiedere l&#39;etichettatura virale di grandi strutture complesse. Prendiamo atto che gli array parallelo iniettore può essere utilizzato per iniettare praticamente qualsiasi carico utile - droga, neuromodulatori, neurotrasmettitori, o addirittura le cellule - in complesso i modelli 3-D nel cervello, in un preciso modo temporalmente. Infine, dal punto di vista traslazionale, è possibile che rapida, paziente personalizzati terapia genica o dispositivi di somministrazione dei farmaci può essere rapidamente appositamente progettati e realizzati per soddisfare geometrie cervello individuale, sostenendo i nuovi trattamenti per una serie di patologie, potenzialmente, mediante l&#39;uso di molecole di controllo ottico. Gli array iniettori sono progettati per essere precisi, sia spazialmente e volumetricamente. In X e Y direzioni, questo viene realizzato dalla perforazione fori molto accuratamente posizionati usando un economico mini-mill, con i fori appena grande abbastanza da contenere gli iniettori, in modo che iniettori sono paralleli l&#39;uno all&#39;altro, e in un preciso posizione. Nella direzione Z, gli iniettori sono tagliati utilizzando un apparato stereotassico, permettendo un livello di precisione equivalente a quello della chirurgia stereotassica stesso. La precisione volumetrica nasce dalla precisione della pompa Hamilton, così come il vicino allo zero volume morto connettori, adattato dal alta pressione cromatografia liquida (HPLC) campo. Gli iniettori sono in tubi capillare di silice fusa, che è forte e sufficientemente rigida che mantiene la forma precisa e la spaziatura sotto pressione, senza lo spessore della parete maggiore di alternative come cannule di acciaio. Piccole modifiche possono facilmente essere fatto per adattare l&#39;array parallelo iniettore ad una serie di esperimenti. Per esempio, se un minor volume di virus o di spaziatura più fine è richiesto, più piccolo tubo capillare può essere impiegato, insieme a un po &#39;più piccolo trapano corrispondente. Futuri dispositivi possono utilizzare canali microfluidica e pompe, per aumentare il numero di iniettori in parallelo, per minimizzare le dimensioni (forse consenta a tali dispositivi da montare sulla testa di muoversi liberamente gli animali).

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<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

La nostra comprensione dei circuiti neurali - come mediare i calcoli che servono alla sensazione, pensiero, emozione e azione, e come essi sono danneggiati nei disordini neurologici e psichiatrici - sarebbe molto facilitata da una tecnologia di targeting dei geni a rapida complessa 3 - dimensionale circuiti neurali, permettendo la creazione veloce di &quot;livello di circuito transgenici&quot;. Abbiamo recentemente sviluppato metodi in cui la codifica dei virus sensibili alla luce per le proteine ​​possono sensibilizzare i tipi di cellule specifiche per millisecondo, tempi di attivazione e silenziamento nel cervello intatto. Noi qui presenti la progettazione e realizzazione di un array iniettore in grado di erogare virus (o altri fluidi) di decine di punti definiti all&#39;interno della struttura 3-dimensionale del cervello (<strong&gt; Figura. 1A, 1B</strong&gt;). L&#39;array iniettore comprende una o più pompe che ogni unità di una serie di siringhe, ognuna delle quali si inserisce in un poliammide / capillare in silice fusa mediante un alta pressione-tolerant connettore. I capillari sono dimensionati, e quindi inserito in, posizioni desiderate specificato da custom-fresatura una scheda stereotassica posizionamento, permettendo virus o altri reagenti da consegnare il set desiderato di regioni del cervello. Per usare il dispositivo, il chirurgo prima riempie il sottosistema fluidico interamente con olio, backfills i capillari con il virus, inserisce il dispositivo nel cervello, e infonde reagenti lentamente (&lt;0,1 microlitri / min). La natura parallelo dell&#39;array iniettore facilita l&#39;etichettatura rapida, precisa e robusta di interi circuiti neurali con carichi virali come sensibilizzatori ottici per permettere alla luce di attivazione e silenziamento dei circuiti cerebrali definite. Insieme con altre tecnologie, come array di fibre ottiche per la consegna della luce ai set desiderato di regioni del cervello, speriamo di creare una serie di strumenti che consente il sistematico sondaggio della causale funzioni neurali del cervello intatto. Questa tecnologia può non solo aprire tali approcci sistematici al circuito incentrato neuroscienze nei mammiferi, e facilitare l&#39;etichettatura delle regioni cerebrali in animali di grandi dimensioni come i primati non umani, ma può anche aprire un percorso clinico-traslazionale di cellule specifiche protesi controllo ottico , la cui precisione può consentire un migliore trattamento delle patologie cerebrali intrattabile. Infine, tali dispositivi come descritto qui può facilitare appunto tempestiva consegna fluidico di carichi altri, come le cellule staminali e agenti farmacologici, a 3 dimensioni delle strutture, in modo facilmente personalizzabile dall&#39;utente.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Controllare e analizzare i circuiti neurali<em&gt; In vivo</em&gt; Potrebbe essere facilitato da una tecnologia per la consegna di virus e altri reagenti di desiderata 3-dimensionale serie di regioni del cervello. Dimostriamo personalizzate fluidico fabbricazione serie iniettore, e la consegna di sensibilizzatori ottici virale codifica, permettendo la manipolazione ottica di circuiti cerebrali complesse.

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Massachusetts Institute of Technology. Controllare e analizzare i circuiti neurali In vivo Potrebbe essere facilitato da una tecnologia per la consegna di virus e altri reagenti di desiderata 3-dimensionale serie di regioni del cervello. Dimostriamo personalizzate fluidico fabbricazione serie iniettore, e la consegna di sensibilizzatori ottici virale codifica, permettendo la manipolazione ottica di circuiti cerebrali complesse.

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Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

Targeting di strutture cerebrali profonde con microiniezioni di consegna dei farmaci, vettori virali, o trapianti di cellule

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

Ricerca

Neuroscienze

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

3-D imaging e analisi di neuroni infetti<em&gt; In Vivo</em&gt; Con<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l&#39;interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Combinando optogenetica con microRNA artificiali per caratterizzare gli effetti del Gene atterramento su funzione presinaptica all'interno di circuiti neuronali intatto

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

Fotometria multifibra per registrare l'attività neurale in animali liberamente

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...