Tutti gli esperimenti sono stati fatti sotto la supervisione del Animal Care Purdue e del Comitato uso e il programma degli animali da laboratorio presso la Purdue University. Questo lavoro è stato patrocinato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (OMT), sotto gli auspici del Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) come parte del programma affidabile tecnologia Neural, attraverso Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013. Gli autori desiderano ringraziare Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, e Kevin Eliceiri per condividere la loro esperienza microscopia.

Soluzioni Soluzione tampone fosfato (PBS) - in g / l; 9 g NaCl, 0,144 g di KH 2 PO 4, 0,795 g di Na 2 HPO 4, a pH 7,4 4% formaldeide - in ml / l; 202 ml di sodio fosfato bibasico soluzione (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml di sodio fosfato monobasico soluzione (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml di soluzione di formaldeide al 8%, 250 ml Milli- Q DDi acqua, a pH 7.4 HEPES salina tamponata di Hank con sodio azide (HBHS) - in g / l, 7,5 g di NaCl, 0,3 g di KCl, 0,06 g di KH 2 PO 4, 0,13 g di Na 2 HPO 4, 2 g di glucosio, 2,4 HEPES g, 0,05 g MgCl 2 6 parti di H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 parti di H 2 O, 0,165 g di CaCl 2, 0,09 g di NaN 3 a pH 7,4 Soluzione di lavaggio (WS) - 1% vol / vol, néSiero di capra normale, 0,3% Triton X-100, in HBHS con sodio azide (NaN 3). Refrigerare il WS a 4 ° C prima dell&#39;utilizzo in fasi successive. U2 Sca l e Solution - 4 M urea, 30% glicerolo e 0,1% Triton X-100 17 PROCEDURA Tutti gli esperimenti sono stati fatti sotto la supervisione del Animal Care Purdue e del Comitato uso e il programma degli animali da laboratorio presso la Purdue University. 1. Chirurgia <ol><li> Vari metodi chirurgiche asettiche sono compatibili con il metodo presentato istologico. L&#39;uso di un telaio stereotassico e inseritori automatici sono raccomandati per migliorare l&#39;impianto riproducibilità e controllo delle matrici di microelettrodi (MEA) angolo rispetto a piani stereotassiche. </li></ol> Nota: In questa dimostrazione il nostro metodo chirurgico è il seguente: tenere il soggetto roditore in stereotassico earbars while sotto anestesia isoflurano (tra il 1-3%) portato dal medico di ossigeno grado. Test per la mancanza di una convergenza pizzico riflettono nel ratto o mancanza di un riflesso tail pinch nel topo per confermare che l&#39;animale è completamente anestetizzato. Applicare pomate oftalmiche e pulire il sito chirurgico con tre lavaggi alternati di Betadine ed etanolo. Lavarsi le mani, guanti chirurgici, alba retina, maschera e abito. Iniettare un bolo di lidocaina per intorpidire la zona chirurgica, creare un&#39;incisione con le forbici o un bisturi, periostio chiaro con raschietto osso e applicatori di cotone, e creare una craniotomia con un manipolo dentale trapano e punta da trapano. Guidare un singolo gambo MEA nella corteccia utilizzando un micromanipolatore. Avere un aiuto assistente chirurgico per mantenere condizioni asettiche chirurgia e documentare i progressi della chirurgia. <ol start="2"><li> Dopo l&#39;impianto del MEA nel cervello, raccogliere immagini attraverso un microscopio chirurgico per informare l&#39;eventuale rimozione del cranio di tutto il bpioggia. Porzioni impiantati dei dispositivi saranno conservati in situ. </li></ol> Nota: L&#39;eventuale raccolta di tessuto con dispositivi in situ dipende strettamente corrispondente piano di inserzione del dispositivo con il piano di sezionamento tessuto. Note dettagliate sul piano di inserimento relativo dispositivo al cervello sono quindi molto importanti. <ol start="3"><li> Dopo l&#39;impianto del dispositivo, applicare l&#39;elastomero siliconico Kwik-Sil (WPI), intorno a qualunque esposto MEA stinchi o dei cavi, e permettono di curare. Un pezzo di plastica sterilizzata, come una punta di pipetta taglio, può essere usato per aiutare a contenere l&#39;elastomero di silicone in una piccola bene intorno al craniotomia durante l&#39;indurimento. </li><li> Applicare uno strato di due parti acrilico dentale (&quot;Liquid Jet&quot; e &quot;Powder Jet&quot; da Lang Dental) il Kwik-Sil e qualsiasi cranio esposto. </li></ol> Nota: In un passo successivo, della paletta viene fuso tramite per consentire l&#39;impianto da separaredal cranio. UV-curing acrilico dovrebbe essere evitato il Kwik-Sil e craniotomia, come questa acrilico molto duro è difficile da rimuovere successivamente. Materiali visivamente opachi intorno all&#39;impianto dovrebbe anche essere evitata; chiaro Kwik-Sil fornisce una vista dell&#39;impianto durante le fasi successive di questo protocollo. <ol start="5"><li> Eseguire le procedure di post-operatorie per la cura come da protocollo locale della normativa sul benessere degli animali, e tornare soggetti ambulatoriali per singolo ospitato gabbia-box. </li></ol> 2. Perfusione e raccolta dei tessuti Nota: vedere Gage et al. per una descrizione dettagliata procedura di perfusione nel modello animale ratto 19. <ol><li> Utilizzare il protocollo di anestesia e perfusione approvato dalla cura degli animali dell&#39;ente e sul comitato per l&#39;uso. Dopo l&#39;anestesia profondamente il roditore (confermato da una mancanza di convergenza pizzico riflesso nel ratto o coda pizzico riflesso nei topi) e di esporre il cuore, fanno poco profondi tagli a forbiceal ventricolo sinistro e dell&#39;atrio destro. Inserire un ago smussato nel ventricolo sinistro e fornire camera temperatura PBS. Fornire un totale di ~ 10 ml PBS a ~ 5 ml / min in topi e ~ 200 ml di PBS a ~ 100 ml / min in ratti. Cercare di depurazione del sangue dal fegato durante. </li><li> Iniettare etichette chimiche istologicamente rilevanti transcardiaca, se lo si desidera, con la consegna siringa facendo attenzione ad evitare l&#39;introduzione di bolle. </li></ol> Nota: le etichette vascolari (ad esempio DII) e nucleici coloranti di contrasto acido (ad es Hoechst 33342) sono esempi di etichette chimiche da consegnare durante la perfusione. Quando somministrato correttamente, questi marcatori istologici dovrebbero etichettare l&#39;intero animale 20. <ol start="3"><li> Consegnare tamponata, temperatura ambiente, 4% di formaldeide transcardiaca per fissare l&#39;animale. Evitare di perforazione del setto attraverso il cuore, che può essere evidenziato da polmone naso drenaggio durante la perfusione. Se vuoi inserire tremori fissaggio dei muscoli grandiper indicare perfusione completo. Consegnare un totale di ~ 10 ml di fissativo a ~ 5 ml / min nei topi e ~ 200 ml di fissativo a ~ 100 ml / min nei ratti. </li><li> A seguito di perfusione, decapitare l&#39;animale, esporre una parte del tronco cerebrale o del cervelletto con rongeurs o forbici, e la testa posto in soluzione di formaldeide al 4% per una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la testa in tre cambi di PBS con 1-4 intervalli di un&#39;ora tra un lavaggio. </li><li> Conservare teste fisse in HBHS contenenti sodio azide a 4 ° C per giorni o mesi. </li></ol> 3. Rimozione cervello con Dispositivi situ Nota: Eseguire questa sezione in una cappa aspirante indossando opportuni dispositivi di protezione. Evitare l&#39;essiccamento dei tessuti restituendo la testa fissa per HBHS soluzione periodicamente. <ol><li> Attenzione sezionare via la pelle e altri tessuti provenienti da tutto il calotta acrilica con pinze e forbici piccole. </li><li> Indossando calore-iguanti nsensitive, usare un saldatore per rimuovere acrilico dentale ed esporre una superficie di base chiara Kwik-Sil (Figura 2a). </li></ol> Nota: Lo scopo di questo passo è consentire micro-forbici un appropriato angolo di accesso a posizioni in cui i dispositivi impiantati entrano nel cervello, in modo che cerebrali impiantati componenti possono essere separati dai componenti fissati al cranio. <ol start="3"><li> Sotto un microscopio chirurgico, tagliato in elastomero di silicone con curve micro-forbici, eliminando piccoli pezzi di Kwik-Sil con pinzette fino alla posizione in cui i dispositivi di entrare nel cervello. </li><li> Continuare il taglio lungo la superficie della craniotomia con curve micro-forbici a componenti separati di dispositivi collegati al polisilicio e cranio da componenti impiantati nel cervello. Anche in questo caso usare l&#39;ingrandimento del microscopio e grande attenzione quando si tagliano attraverso i componenti del dispositivo esposti, avendo cura di evitare di spingere o trascinare l&#39;implanti nel tessuto fisso. </li><li> Togliere l&#39;osso intorno al Cuffia con cura usando rongeurs. Utilizzare una spatola per separare il cervello con dispositivi impiantati dal cranio. Conservare il cervello in soluzione HBHS fino al momento di tagliare. </li><li> Posizionare il cervello in un piatto di vetro riempito di Petri HBHS, e uso di un rasoio per rimuovere il tessuto estraneo, come midollo spinale, cervelletto, o bulbo olfattivo, a seconda che sono rilevanti per la posizione del dispositivo di impianto. Utilizzare un blocco cerebrale (Ted Pella) e lame di rasoio alla sezione del cervello e creare un piano piatto ampiamente le angolo dei dispositivi impiantati, questo è realizzato mettendo il cervello in un blocco cervello di dimensioni adeguate, orientando il cervello tale che qualsiasi parte visibile dell&#39;impianto è parallelo alla guida di lama di rasoio, e mettendo una lama di rasoio in un guidalama almeno 2 mm dall&#39;impianto. Premere il lametta attraverso il tessuto. Montare questa superficie ad una piattaforma vibratomo. Alternamente, una lama di rasoio montato un micromanipolatore può essere utilizzato in modo altrettanto controllato come il blocco cervello per creare un piano strettamente corrispondente alla direzione dell&#39;impianto. </li><li> Posizionare ghiaccio sotto la piattaforma vibratomo, e, dopo aver lasciato la superficie del tessuto ad asciugare brevemente su un tovagliolo di carta, aderiscono il cervello a un vibratomo con Super Glue. Incollare il piano di tessuto piatto creato nel passaggio precedente è allo stadio. Con dimensioni di tessuto asimmetrici, orientare il campione in modo che la dimensione maggiore viene incollato parallelo alla direzione di movimento della lama vibratomo per evitare la lama potenzialmente battendo il tessuto sopra. Dopo i set colla (~ 1-2 min), aggiungere refrigerati (~ 4 ° C) PBS al piatto vibratomo intorno al tessuto. </li><li> Raccolta di sezioni di tessuto dello spessore tra 200-400 micron, compresi i tessuti di controllo, utilizzando la massima velocità di vibrazione (~ 100 Hz) e una lenta progressione lama (&lt;0,2 mm al secondo), con un angolo di 10 ° lama da Horizontal. Raccolta di sezioni accuratamente con una spatola o pennello scoop e conservare in HBHS in una piastra a 24 pozzetti a 4 ° C. </li><li> Una volta che il dispositivo in situ è visibile ad occhio nudo o un microscopio chirurgico, raccogliere sezioni più sottili di avvicinarsi al dispositivo in incrementi fetta di 100 um o meno. </li></ol> Nota: tipiche di silicio micro-impianti sono visibili ad occhio nudo in formaldeide-fisso tessuto corteccia cerebrale di roditori tra 300 e 500 micron dalla superficie del dispositivo. <ol start="10"><li> Con il dispositivo in situ ora vicino alla superficie del tessuto, raccogliere una fetta tessuto&gt; 250 micron contenente il dispositivo all&#39;interno. Stima dello spessore necessario può essere aiutata da fette di riferimento precedentemente raccolti. </li></ol> Nota: i dispositivi più grandi, dispositivi multidenti e dispositivi ad angolo possono richiedere fette di tessuto spessi (&gt; 500 micron) per catturare il dispositivo in un solo pezzo del tessuto; remembro che sia la penetrazione di etichette applicate e la profondità di imaging microscopia sarà limitata nella eventuale raccolta dati da queste fette molto spesse. Se possibile, evitare di colpire il dispositivo con la lama vibratomo, come questo può causare trascinamento del dispositivo attraverso la deformazione dei tessuti e morfologiche. 4. Tessuto di esecuzione e compensazione <ol><li> Lavare 3 volte a fette di 5 minuti per lavaggio in HBHS </li><li> Incubare in boroidruro di sodio (5 mg NaBH 4/1 ml di HBHS) per un totale di 30 min (15 min ogni lato della fetta). Capovolgere le fette con un acciaio inossidabile o in Teflon rivestito cucchiaio micro e pennello piccolo (Ted Pella). Movimenti lenti e riflessivo migliorare il successo di ciascun flip fetta. Evitare di toccare le aree intorno al dispositivo impiantato con il pennello. Quando possibile, aggiungere la soluzione notevolmente più richiesto (&gt; 2 ml) permette di manipolare e capovolgere le fette di tessuto più facilmente. </li></ol>Nota: Questo passo riduce endogena autofluorescenza, saltare questo passaggio se le etichette fluorescenti sono state applicate durante la perfusione o XFP marcatori transgenici sono presenti. <ol start="3"><li> Lavare 3x fette a 5 min a lavaggio in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente. </li></ol> Nota: agitazione durante le fasi di lavaggio e l&#39;incubazione è opzionale. Gli autori ipotizzano che sottile stridente dell&#39;impianto rigida rispetto al tessuto cerebrale circostante può verificarsi con agitazione. Tuttavia, un mixer orbitale spostano ad una velocità dolce (&lt;60 rpm) può evitare questo, aumentando la circolazione di soluzioni. <ol start="4"><li> Blocco per 2 ore in soluzione di lavaggio a temperatura ambiente (a fogli mobili fette dopo un&#39;ora). </li><li> Incubare in anticorpi primari (diluito in soluzione di lavaggio) per circa 48 ore (24 ore su ciascun lato della fetta) a 4 ° C. </li><li> Effettuare 3 lavaggi rapidi 6 min con soluzione di lavaggio. </li><li> Eseguire 6, 1 ora (3 lavaggi lavaggioes su ciascun lato del tessuto slice) in soluzione di lavaggio (conservare a 4 ° C durante la notte se lavaggio). </li><li> Incubare in anticorpi secondari (diluito con soluzione di lavaggio) per circa 48 ore (24 ore per lato) a 4 ° C. </li><li> Effettuare 3 lavaggi rapidi 6 min con soluzione di lavaggio. </li><li> Eseguire 6, 1 ora lavaggi (3 lavaggi su ogni lato) in soluzione di lavaggio, conservare a 4 ° C, se il lavaggio durante la notte. </li><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere il glicerolo-based &quot;U2 - Sca l e&quot; soluzione di compensazione. Permette di cancellare circa 1 settimana per fette spesse (250-500 micron) o 2-3 settimane per sezioni di tessuto di grande spessore (&gt; 500 micron) a 4 ° C. </li><li> Coprire la piastra con pellicola e conservare a 4 ° C. </li><li> Montare in diapositive in grado di ospitare sezioni di tessuto di spessore (figura 2b, 2c) con la soluzione di compensazione come mezzo di montaggio e sigillatura con smalto trasparente. Conservare a 4 ° C al riparo dalla luce. </li></ol> 5. Panorama Imaging di Full TiUMERO e Device Interface <ol><li> Utilizzo di più lungo lavoro obiettivi microscopio a distanza (&gt; 2 mm), iniziano di esposizione con un microscopio confocale a scansione laser o 2-fotone microscopio. Dimostreremo con una Zeiss LSM 710, Carl Zeiss software &quot;Zen&quot; (2010), e un computer controllato fase XY si traducono in immagine un panorama 3D attorno ad un impianto. </li></ol> Nota: corretto per l&#39;indice di rifrazione della soluzione di compensazione sia in software, attraverso un collare correttivo sull&#39;obiettivo, o nel trattamento dei dati dopo la raccolta. In questa dimostrazione si entra in un valore indice di rifrazione per la soluzione di compensazione &quot;U2&quot; di 1,4 nel Zen software microscopio Leica, questa impostazione consente di regolare in modo sottile z-passo intervalli per spiegare mancata corrispondenza indice di rifrazione. <ol start="2"><li> Nel tessuto in prossimità del dispositivo, più o meno valutare le opportune asse z impostazioni di una raccolta delle finestre e dati nella z-dimensione per ciascun canale fluorescente con laser a bassa potenza (~ 00,5-5%) e di grandi dimensioni z-passo (&gt; 25 micron). </li></ol> Nota: Includere spazio sopra e sotto quando si imposta l&#39;asse z durante la configurazione per panoramica raccolta dei dati, in quanto il tessuto non può trovarsi completamente piatto sul vetrino (~ 20 micron per ogni direzione). <ol start="3"><li> Impostare l&#39;obiettivo al centro xy del panorama finale, utilizzando il software Zen panorama, determinare il numero di posizioni di raccolta richieste per ogni asse (x e y) per coprire la vostra regione di interesse. </li><li> Rivalutare e finalizzare l&#39;asse z finestra di raccolta. </li><li> Impostare manualmente la sensibilità del rivelatore e la potenza del laser a far decollare in modo appropriato con maggiore profondità, lo scopo è in genere di mantenere all&#39;incirca la stessa intensità dell&#39;immagine a qualsiasi profondità di imaging nella sezione tessuto, ma per evitare anche il rumore di fondo elevato. </li><li> Raccogliere ogni fluorescente serie di immagini di dati. Se necessario, per evitare la sovrapposizione di segnali, eseguire linea lasers sequenziale. </li></ol> Nota: Se disponibile, impostare il software di salvare automaticamente i dati sul disco rigido durante la raccolta. <ol start="7"><li> Modificare le impostazioni del software per raccogliere la &quot;riflessione&quot; e &quot;trasmittanza&quot; dati, e utilizzare più una, laser lunghezza d&#39;onda più penetranti (per esempio 633 nm) per catturare questi canali. Determinare la potenza del laser e la sensibilità del rivelatore per &quot;riflessione&quot; e raccolta &quot;trasmittanza&quot; e ripetere la stessa serie di raccolta intorno al dispositivo impiantato. </li><li> Esportare i dati per l&#39;elaborazione successiva, quantificazione e analisi. </li></ol>

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Gli autori non hanno i dati pertinenti per dichiarare, finanziario o di altro tipo.

Il &quot;Device-Capture Istologia&quot; (DCHist) metodo illustrato qui consente la valutazione istologica stretta delle interazioni morfologicamente conservate tra i tessuti cerebrali e impianti di tessuto. Tessuto collezione DCHist richiede un&#39;attenta separazione del cranio montati componenti del dispositivo da componenti impiantati nel cervello. DCHist richiede anche la raccolta di una grossa fetta del tessuto istologico (&gt; 250 micron). Queste sezioni di tessuto, una volta etichettati, eliminato, montato, e con immagini, in grado di fornire nuove intuizioni nel pregiudizio impianto o cronica conseguente risposta ai dispositivi a permanenza. Utilizzando strumenti di microscopia avanzata, l&#39;interfaccia tra il tessuto e il dispositivo può essere ripreso e analizzato in dettaglio alto come mostrato nelle figure 3-5. Le tecniche presentate nella loro forma attuale si basano sulla capacità di scavare lentamente il Cuffia realizzata in due parti di cemento dentale e Kwik-Sil fino al punto di impianto del dispositivo.Utilizzando cemento dentale che può essere bruciato o rimosso e un elastomero silicone trasparente attraverso cui piccole forbici può essere guidato visivamente grande aiuto nel successo separare il dispositivo impiantato dalle cranio montati componenti. Tentativo di ridurre il dispositivo sotto il cranio e sopra il cervello per raccogliere in situ non è raccomandato, come il cranio montato impianto sarà estratta dal cervello una quantità significativa. Anche se più sottili, gli impianti più piccoli, come singoli accordi multilaterali gambo di Tecnologie NeuroNexus, sono più suscettibili di DCHist, i principi non sono limitati a gambo singolo dispositivo o matrici di microelettrodi. Raccolta e strategie di imaging sono sostanzialmente applicabili ai dispositivi multi-gambo e grandi impianti come cannule, con i requisiti è che essi devono essere separati da qualsiasi supporto cranio e raccolte all&#39;interno di una sezione di tessuto di spessore. Sebbene gli autori sono focalizzati sulla analisi del tessutocircostanti gli impianti corticali, i dispositivi guidati più in profondità nel cervello potrebbe anche essere raccolte e ripreso. La profondità di inserimento dell&#39;impianto non dovrebbe influenzare la cattura dell&#39;impianto in una fetta fornito il dispositivo non si discosta notevolmente da l&#39;angolo noto di inserimento. Limitazioni esistono per l&#39;utile applicazione del metodo DCHist. Sezioni di tessuto cerebrale sono difficili da immagine attraverso centinaia di micrometri, soprattutto nelle aree di sostanza bianca, anche se le soluzioni di compensazione ottica può notevolmente migliorare la profondità di imaging in diversi tessuti 21. Per migliorare ulteriormente la profondità di imaging, microscopia a due fotoni di eccitazione può essere impiegato insieme con la compensazione ottica descritta. Un&#39;altra potenziale limitazione del metodo descritto può essere i metodi specifici immunoistochimica fluorescenti e anticorpi impiegati dai ricercatori. Diffusione passiva spinge in genere l&#39;integrazione di questi marcatori attraverso il tessuto fissoe sui siti di legame dell&#39;antigene. Le concentrazioni finali di lavoro degli anticorpi deve essere determinata dai ricercatori su un caso per caso per massimizzare la penetrazione del marchio, evitando alti livelli di etichettatura sfondo. Etichettatura anticorpo non deve essere variabile tra fette che vengono elaborati in modo identico, ma differenti anticorpi possono variare notevolmente nella loro capacità di penetrare e contrassegnare loro antigene, con alcuni anticorpi facilmente etichettatura antigeni molte centinaia di micrometri profonde e di altri antigeni etichettatura solo decine di micrometri profonda. Descriviamo migliorare questa diffusione applicando etichette anticorpali superiori a concentrazioni tipiche, per più giorni di applicazione, e in una soluzione contenente detergente diluita e bloccando siero. Periodicamente lanciando le fette promuove anche l&#39;etichettatura. Fasi di recupero Antigen e processi di fissaggio alternativi (ad esempio glutaraldeide, forno a microonde, ecc) può essere adatto per antigeni specifici. Anticorpo secondario-fluorochconiugati roma possono variare anche in loro prestazioni etichettatura sezioni spesse, anche se questo non è stato osservato dagli autori con Alexa Fluor etichette da Invitrogen. In alternativa, soggetti animali transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti nei tipi cellulari di interesse può essere utilizzato per evitare problemi con la penetrazione anticorpo etichetta, come molte proteine ​​fluorescenti come eGFP, mantengono la loro fluorescenza dopo trattamento con formaldeide, e può essere immediatamente visualizzata in sezioni di tessuto. DCHist è un potente insieme di tecniche per catturare e analizzare l&#39;impatto di microdispositivi impiantati sul tessuto cerebrale. Giunto questo protocollo istologico con valutazione in vivo della qualità elettrofisiologia e dati di impedenza elettrodo 22 potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione delle origini biologiche della variabilità fisiologia e del degrado. Il campo di impiantati dispositivi protesici neurali, in particolare, possono beneficiare il dettaglio DCHist imaging del dispositivo intatto / tessuto di interfaccia per informare ulteriore sviluppo biologicamente neutrali dispositivi MEA.

Il campo di neuroprosthetic ricerca si propone di aiutare le persone che soffrono di varie disabilità e disturbi bypassando le strutture malate o danneggiate nel corpo attraverso il sistema nervoso centrale di interfacciamento 1,2 dispositivi. Microdispositivi Brain-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi (MEA), può essere utilizzato per registrare o stimolare strutture cerebrali, e permettere così la creazione di interfacce a lungo termine tra l&#39;elettronica e dei tessuti del SNC 3-5. MEA penetranti, i dispositivi che sono conficcati nel tessuto cerebrale, promettenti come interfacce particolare a causa della vicinanza entro il quale essi presentano elettrodi a un insieme relativamente piccolo di neuroni vicini 6 bi-direzionali. Tuttavia, complesso risultato tessuto risposte dal lungo termine impianto di MEA penetranti, spesso con conseguente variabili e gradualmente degradanti elettrofisiologiche segnale-rumore rapporto più giorni a mesi, e un aumento impedenza elettricazione tra i siti degli elettrodi e la massa 7,8. Le origini putativi di questi cambiamenti includono l&#39;attivazione della microglia, astrocitosi reattiva lungo i microdispositivi, e una perdita di neuroni o migrazione dal tessuto circostante per dispositivi impiantati 9-11. Una sfida importante per la comprensione di questi cambiamenti del tessuto intorno croniche, AAM penetrazione è la difficoltà di acquisizione dei dati istologici dell&#39;interfaccia tessuto intatto circostante dispositivi impiantati cronicamente 12. L&#39;analisi istologica del tessuto con il dispositivo / interfaccia tessuto ancora presente sarebbe migliorare l&#39;attuale dispositivo di rimozione protocolli istologici. Con un dispositivo indisturbata rimanendo nel tessuto, l&#39;effetto biologico di interazioni relativamente sottili, come l&#39;utilizzo di rivestimenti biocompatibili 13,14 o la compensazione elettrica della superficie dell&#39;elettrodo, 15,16 potrebbero essere esposte e analizzati rispetto all&#39;impianto. Hprima che si dimostra un metodo per raccogliere, elaborare, e l&#39;immagine l&#39;interfaccia microdispositivo intatta per microscopia dettagliata basata su un&#39;analisi del tessuto cerebrale circostante. In questo metodo, il dispositivo e il tessuto cerebrale circostante vengono raccolti in una spessa (&gt; 250 micron) sezione di tessuto utilizzando un vibratomo. Per migliorare la penetrazione istologico etichetta in queste fette spesse, etichette fluorescenti istochimiche ed immunoistochimiche sono applicati in concentrazioni elevate in soluzioni contenenti siero di blocco e detersivo per più giorni. Una soluzione di compensazione ottica viene utilizzato per migliorare la profondità di imaging microscopia, e il tessuto è montato in 2-sided camere per la successiva scansione laser microscopia confocale 17. Per catturare l&#39;interfaccia completa istologico, un computer controllato stadio traslazionale viene utilizzato durante l&#39;imaging per raccogliere Z-stack panorami lungo la lunghezza della protesi. Oltre all&#39;imaging applicare etichette tessuti, raccogliendo riflettanza laser indietro da impiantie la trasmissione della luce attraverso il tessuto sia aiuto localizzare l&#39;interfaccia dispositivo in relazione al tessuto circostante. Tissue redatto utilizzando questo &quot;Device-Capture Istologia&quot; (DCHist) protocollo prevede l&#39;accesso di imaging per le morfologicamente conservati tessuti / dispositivo di interazioni, e migliora così al precedente dispositivo di rimozione protocolli istologici 18.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> DNA marcatore </td></tr><tr><td> Coniglio anti-Iba1 </td><td> Wako (Giappone) </td><td> 019-19741 </td><td> Anticorpo monociti </td></tr><tr><td> Acrilico dentale </td><td> Lang Dental (vari distributori) </td><td> Jet protesi polvere Repair &amp; Liquid </td><td> Cuffia costruzione </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> KWIK-SIL </td><td> Copertura esposti impianti craniali </td></tr><tr><td> Siero di capra normale </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 005-000-121 </td><td> Tessuto di elaborazione </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Tessuto di elaborazione </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Cancellazione soluzione </td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Cancellazione soluzione </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Curve micro-forbici </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14208 </td><td> Impianto di taglio prima di rimuovere il cervello </td></tr><tr><td> Lamette da barba </td><td> Ted Pella </td><td> (Varie dimensioni) </td><td> Per l&#39;utilizzo con blocco del cervello </td></tr><tr><td> Acrilico Cervello Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Cervello blocco per creare piano di partenza nel tessuto </td></tr><tr><td> Scivoli di plastica </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Tessuto di montaggio </td></tr><tr><td> Copertura in vetro </td><td> Ted Pella </td><td> (Varie dimensioni) </td><td> Tessuto di montaggio </td></tr><tr><td> Elettrodi array </td><td> NeuroNexus Technologies </td><td> (Diverse versioni) </td><td> Esempio MEA </td></tr><tr><td> Vibratomo </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Sistema specifico utilizzato nel metodo presentato </td></tr><tr><td> Lame vibratomo </td><td> (Diversi fornitori) </td><td></td><td> Raccolta fette </td></tr><tr><td> Piastre da 24 pozzetti </td><td> (Diversi fornitori) </td><td></td><td> Memorizzazione ed elaborazione fette di tessuto </td></tr><tr><td> Microscopio confocale a scansione XY motorizzata stadio </td><td> Carl Zeiss Microscopy </td><td> Software Zeiss LSM 710 e &#39;Zen 2010&#39; </td><td> Sistema specifico utilizzato nel metodo presentato </td></tr><tr><td> Saldatore </td><td> (Diversi fornitori) </td><td></td><td> Lavori di scavo Cuffia </td></tr></tbody></table>

intact histological characterization of brain-implanted microdevices and surrounding tissue

La ricerca sulla progettazione e l&#39;utilizzo di microdispositivi cervello-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi, mira a produrre dispositivi clinicamente rilevanti che si interfacciano per lungo tempo con il tessuto cerebrale circostante. Tessuto circostante questi impianti è pensato per reagire alla presenza dei dispositivi nel tempo, che comprende la formazione di un isolante &quot;cicatrice gliale&quot; attorno ai dispositivi. Tuttavia, l&#39;analisi istologica di questi cambiamenti del tessuto viene tipicamente eseguita dopo espianto del dispositivo, in un processo che può disturbare la morfologia del tessuto di interesse. Qui mostriamo un protocollo in cui sono raccolti corticali-impiantati dispositivi intatto nel circostante tessuto cerebrale dei roditori. Descriviamo come, una volta perfusi con fissativo, cervelli vengono rimossi e tranciato in modo da evitare dispositivi dell&#39;espianto. Abbiamo delineare etichettatura immunofluorescenza e metodi di compensazione ottica utili per la produzione di carattere informativo, ma di spessore del tessutosezione. Infine, dimostriamo il montaggio e immagini di queste sezioni di tessuto al fine di indagare l&#39;interfaccia biologica intorno cerebrali impiantati dispositivi.

MEA cervello impiantati possono essere raccolti in fettine di tessuto dal primo separando eventuali cranio montati componenti dal cervello incorporate componenti. Figura 2a mostra i risultati di rimozione di un lato di una paletta in cemento dentale ed una porzione di Kwik-Sil circonda un cavo MEA su un cranio ratto. Un saldatore è stato utilizzato per rimuovere il cemento dentale e Kwik-Sil in una cappa aspirante. Il cablaggio e le strutture non sono stati impiantati MEA prossima tagliati con micro-forbici lentamente scavando attraverso il Kwik-Sil fino alla superficie del cervello fisso. Dopo il taglio, l&#39;etichettatura, e la rimozione dei tessuti, semplici misura diapositive sono utili per il montaggio delle fettine di tessuto di spessore (Figura 2b). Una fetta cervello montato contenente un microdispositivo impiantato è mostrato in Figura 2c. Imaging attraverso entrambi i lati della slitta può consentire di valutare l&#39;interfaccia intorno a un dispositivo, come mostrato in figura 3 </strong&gt;, dove microglia lungo il supporto di silicio di un MEA sono visibili da un lato (Figura 3a) e microglia lungo degli elettrodi e tracce sono visibili sul lato opposto (Figura 3b). Una volta montato, il tessuto può essere ripreso utilizzando una piattaforma di traslazione XY. Panoramica di etichette fluorescenti attraverso intere fette di tessuto può essere generato con la risoluzione desiderata (Figura 4). Esame dettagliato dell&#39;interfaccia tessuto morfologicamente conservati intorno microdispositivi impiantati possono essere raccolti ad alti ingrandimenti per l&#39;analisi della risposta del tessuto locale (Figura 5). <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Figura 1. Panoramica della procedura. (Ac) Cervello micro-impianto interventi sono finalizzati con uno strato di polimero Kwik-Sil immediatamente circostante il dispositivo, seguito da un rivestimento cemento acrilico. (D, e) eutanasia seguito, lo strato acrilico viene bruciata, e cranio montati componenti del dispositivo sono separati dai componenti impiantati tagliando attraverso l&#39;elastomero siliconico. (F, g) Il cervello viene quindi rimosso dal cranio e viene tagliato e montato alla fase vibratomo. (Hk) fette di tessuto sono raccolti, compresa una fetta tessuto contenente il dispositivo. (L) del tessuto possono essere elaborati e montati in camere personalizzate per la microscopia dettagliata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. (A) Cancellare Kwik-Sil do elastomero di siliconerrounding un elettrodo-array cavo (freccia) è stato esposto da bruciando una finestra nel tappo cemento dentale sulla testa di un roditore perfuso con un saldatore. (B) Per accogliere l&#39;imaging in entrambi i lati di una fetta tessuto spesso, semplice &quot;slide-camere&quot; può essere realizzato tagliando un vetrino coprioggetto plastica e aderendo ai lati intorno al tessuto e soluzione di montaggio. (C) Un cervello di ratto fetta del tessuto con l&#39;impianto intatto (freccia rossa) viene mostrato dopo il montaggio. Entrambi i lati del tessuto è rapidamente accessibile a immagini di microscopia con questa configurazione. Per scala, pannello (a) è di 25 mm di diametro in basso, mentre i pannelli (b, c) sono 80 mm di diametro in basso. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Figura 3. Int massimaensity z-proiezioni di 40 micron stacks di immagini spesse, raccolte attorno al retro (a) e anteriore (b) di una matrice microelettrodo impiantato. Microglia (marcato con anti-Iba1 e Alexa Fluor 633, bianco) e la riflessione della luce laser (rosso), raccolte dalla superficie del dispositivo, sono stati sequenzialmente ripreso da entrambi i lati di una fetta tessuto 400 micron di spessore. Come gli impianti cerebrali sono spesso opaco, montaggio con accesso ottico ad entrambi i lati fornisce una chiara visione di strutture tessutali etichettati &quot;dietro&quot; dell&#39;impianto rispetto all&#39;obiettivo microscopio. Scala bar 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Una fetta DCHist etichettato ripreso utilizzando un computer controllato tappa di un microscopio confocale a scansione laser. (A) nuclei cellulari (colorate con Hoechst 33342) e (b) monociti / microglia(Contrassegnato con anti-Iba1) sono stati contemporaneamente stampato su canali separati. (C) trasmissione di luce e la riflettanza sono stati raccolti, che mostra la posizione del 4-settimane impianto rispetto a Hoechst e Iba1 dati. (D) Sovrapposizione di tutti i canali di trasmissione, ma è anche mostrato. L&#39;area rettangolo bianco si espande nelle immagini che appaiono a destra. Scala bar 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Figura 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Figura 5. Utilizzando un computer controllato da tavolino del microscopio e software appropriato, dati di immagini panoramiche possono essere raccolti intorno all&#39;impianto. Riflettanza (a) e trasmittanza (b) consentire una localizzazione del dispositivo, mentre le etichette fluorescenti anticorpo o chimiche (c, anti-Iba1 etichettatura della microglia e macrophages) permettono immagini dettagliate delle componenti del tessuto lungo l&#39;interfaccia tessuto intatto. Scala bar 200 micron.

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Qui vi presentiamo un metodo istologico per l&#39;acquisizione, l&#39;etichettatura, otticamente compensazione, e di imaging intatto interfaccia tessuto cerebrale intorno microdispositivi cronicamente impiantati nel tessuto cerebrale dei roditori. Risultati dalle tecniche comprendenti questo metodo sono utili per comprendere l&#39;impatto delle varie penetranti cerebrali impianti sul loro tessuto circostante.

Intatta Caratterizzazione istologica di Microdevices Brain-impiantati e il tessuto circostante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K Views.  Purdue University. Qui vi presentiamo un metodo istologico per l'acquisizione, l'etichettatura, otticamente compensazione, e di imaging intatto interfaccia tessuto cerebrale intorno microdispositivi cronicamente impiantati nel tessuto cerebrale dei roditori. Risultati dalle tecniche comprendenti questo metodo sono utili per comprendere l'impatto delle varie penetranti cerebrali impianti sul loro tessuto circostante.

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Gli array scalabile fluidico Iniettore per Viral targeting di intatto 3-D circuiti cerebrali

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Neuroscienze

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

Modellazione 3D del laterale ventricoli e istologica Caratterizzazione del Tissue periventricolare di esseri umani e il mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

L&#39;esposizione del Maiale CNS per l&#39;analisi istologica: Un manuale per la decapitazione, Teschio di apertura, e Cervello di rimozione

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

Elettroencefalografici, frequenza cardiaca e valutazione di risposta galvanica della pelle per una percezione di pubblicità Studio: applicazione per annunci di servizio pubblico antifumo

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modello del ratto dell'ipoperfusione lieve intrauterina con stenosi Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...