This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Tutte le procedure sono state approvate dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso la University of Illinois. Tutti gli animali sono stati alloggiati in strutture di cura degli animali approvato dalla Associazione Americana per l&#39;accreditamento di cura degli animali da laboratorio. Ogni tentativo è stato fatto per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati e di ridurre la sofferenza in tutte le fasi dello studio. 1. La preparazione e la rimozione di Brain Mouse affettare <ol><li> Prepararsi per la perfusione e la fetta di incubazione. <ol><li> Circa 30 minuti prima di tagliare, preparare ad alta soluzione di taglio di saccarosio e basso aCSF calcio per l&#39;incubazione della fetta prima della registrazione o l&#39;imaging. </li><li> Disporre tutti gli strumenti necessari (grandi forbici spuntate finali, piccole forbici primavera, pinze anatomiche, grandi forbici o ghigliottina, iride forbici, pinze, gioiellerie 10 ml siringa con ago 27G x 1/2 pollice, piccolo pezzo di 1 cm di filtro x 2 cm carta, e un rotto punta pipetta Pasteur per sltrasferimento ghiaccio) per la perfusione e affettare, e preparare vassoio di perfusione. </li><li> Istituito incubazione da camera con ossigenato aCSF in un bagno d&#39;acqua C 32 o e un piatto di cultura piena di soluzione di taglio. </li></ol></li><li> Preparare fase di taglio per affettare. <ol><li> Tagliare un piccolo pezzo di 3% agar circa 1 cm 3 da utilizzare come arresto per il cervello e 1.5 cm x 1.5 mm x 3 mm per un urto da utilizzare per sostenere l&#39;IC. </li><li> Colla l&#39;arresto sul palco con cianoacrilato nonché l&#39;urto sul lato destro del blocco d&#39;inversione tale da formare un angolo di 80 °. </li></ol></li><li> Rimuovere il cervello. <ol><li> Profondamente anestetizzare un p12-P20 (idealmente p14-18) mouse con ketamina 100 mg / kg e xylaxine 3 mg / kg (o comitato etico comparabili procedura approvata). Nota: Verificare il corretto livello di anestesia con mancata risposta alla pizzico piedi. Poiché l&#39;animale è sotto anestesia brevemente, pomata oftalmica è inutile. </li><li> Utilizzando smussatoterminare forbici, esporre la gabbia toracica dal processo xifoideo al collo. <ol><li> Trovare il processo xifoideo, e fare un taglio orizzontale di circa 1,5 centimetri. </li><li> Fare due tagli verticali dalle estremità del precedente taglio orizzontale alle spalle, circa 1,5 cm ciascuno. </li></ol></li><li> Tagliare attraverso il diaframma e le giunzioni costocondrali per esporre il cuore. </li><li> Con piccole forbici primavera, fare un piccolo, 2-5 tagliare nell&#39;atrio destro mm, dal lato dorsale ventrale del cuore. </li><li> Usando una siringa da 10 ml con un ago 27G x 1/2 pollice, iniettare il ventricolo sinistro e profumato rapidamente l&#39;animale con alta soluzione di taglio saccarosio. </li><li> Una volta che il sangue scorre chiaro, usare le forbici più grandi per rimuovere la testa. Nota: Non abbiamo sistematicamente valutato l&#39;utilità di perfusione. Tuttavia, nella nostra esperienza, transcardiac perfusione nei topi giovani questo può essere fatto con quasi il 100% di successo, e che hanno il vantaggio di eliminare bl rossoOOD cellule, che possono interferire con fluorescenza e di imaging. </li><li> Tagliare la pelle verso il basso la linea mediana per esporre il cranio. </li><li> Utilizzando iris piegate forbici, tagliare il cranio in mezzo agli occhi, poi a partire dal taglio tra gli occhi, accuratamente tagliato da anteriore a posteriore lungo la linea mediana di sutura facendo attenzione a non danneggiare il cervello sotto. Nota: La dura di solito viene fuori con il cranio. Se necessario, rimuovere la dura prima di rimuovere accuratamente il cervello. </li><li> Utilizzando gioiellerie pinze, leva aprire il cranio e rimuovere con attenzione il cervello, quindi inserire il cervello in soluzione di taglio. Fare attenzione a non danneggiare le cortecce. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del cervello per affettare <ol><li> Preparazione del cervello per il montaggio su vibratome palco. <ol><li> Utilizzando una diapositiva segnato con due linee a 90 ° e una linea diagonale a 17 o dalla parte superiore sinistra a destra in basso, si intersecano in cui le due linee si incontrano, posizionare il lato dorsale del cervello fino, utilizzandouna lama di rasoio, rimuovere 2-4 mm del cervello fine rostrale creando una superficie piana. </li><li> Posizionare il lato caudale del cervello sulla superficie piatta di nuova creazione, e allineare la superficie dorsale del cervello con l&#39;orizzontale e la linea mediana del cervello con la linea verticale. </li><li> Allineare la lama di rasoio con la linea 17 o, inclinare il rasoio in un angolo di 30 ° e di rimuovere circa 3 mm della corteccia destra in un doppio taglio diagonale (17 o dal piano orizzontale e 60 o dalla coronale). </li></ol></li><li> Cervello Montaggio su vibratome palco. <ol><li> Mettere un piccolo pezzo di carta da filtro 1 cm x 2 cm sul lato ventrale del cervello in modo che la dimensione lunga è perpendicolare alla linea mediana. </li><li> Applicare delicatamente una piccola quantità di adesivo cianoacrilato alla zona di fronte al blocco d&#39;inversione (ea sinistra del urto). </li><li> Posizionare la doppia faccia del cervello in diagonale taglio al colla in modo che la parte caudale del cervello e romboencefalo sono propped sulla urto e il lato destro del cervello è contro l&#39;arresto. </li><li> Delicatamente premere sul cervello, garantendo che l&#39;intera superficie è a contatto con la camera di affettatura. </li></ol></li></ol> 3. Ottenere la Colliculo-thalamocortical Slice <ol><li> Prendere rapidamente la fase di taglio e posto nel vibratome, riempire il palco con la soluzione di taglio. </li><li> Allineare la lama con la parte superiore (lato ventrale) del cervello. </li><li> Rimuovere 1-1,5 mm dalla parte superiore del cervello, rimuovere 300-500 micron fette e valutare la profondità dopo la rimozione. Nota: Quando l&#39;IC, il MGB, e il nucleo genicolato laterale (LGN) sono tutte visibili, e il giro dentato costituisce una forma di &#39;C&#39; prendere uno a due 600 micron fette. Vedere la Figura 3A. </li><li> Mettere le fette in camera riscaldata (32 ° C) che tiene. </li></ol> 4. Imaging del Slice <ol><li> Preparazione per l&#39;imaging flavoproteina autofluorescenza. <ol> &lt;li&gt; Preparare aCSF per la perfusione di fetta in una camera di registrazione elettrofisiologica standard bolla aCSF con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Tirare elettrodo di vetro per la stimolazione. Si noti che più elettrodi stimolanti diversi e configurazioni (vetro, tungsteno, fibra di carbonio, monopolare, bipolare) tutto il lavoro molto bene in congiunzione con l&#39;imaging flavoproteina autofluorescenza. </li><li> Accendere il computer, la macchina fotografica, micromanipolatore, fonte di luce, software stimolazione, software per immagini. </li><li> Profumato camera di registrazione con ossigenato aCSF, posizionare il ponte personalizzato (disegno disponibile in Materiali Supplementari) per elevare fetta nella camera. Nota: tasso di perfusione può variare con qualsiasi individuo istituito; 5-15 ml / min è usato qui. </li><li> Mettere fetta nella camera, abbassare il livello del liquido nella camera per evitare che la fetta da sollevare dal ponte mentre si posiziona arpa appositamente costruito su fetta, avendo cura di evitare di mettere corde dell&#39;arpa su percorsi di interrelazioneest (Figura 1A). Aumentare il livello del liquido a circa 1-2 mm al di sopra fetta di mantenere il flusso aCSF sopra e sotto la fetta. Nota: se riposizionamento è necessario, utilizzare l&#39;estremità pipetta Pasteur rotto o consentire il livello aCSF a salire e utilizzare pinze con estrema cura. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo cloruro d&#39;argento in elettrodo di vetro riempita con aCSF, inserire l&#39;elettrodo di vetro in micromanipolatore e connettersi allo stimolo isolante, e posizionare con cura elettrodo di vetro in IC / sostanza bianca che porta al talamo (vedere Figura 1A). </li></ol></li><li> Flavoprotein autofluorescenza acquisizione delle immagini. <ol><li> Raccogliere immagini a 4 Hz (utilizzando un 2X macro obiettivo infinito corretta (NA 0,13)) e una macchina fotografica per 105 secondi mentre elettricamente stimolante (ogni stimolazione è composto da 1 sec di 40 Hz 2 msec impulsi tessuto a 0,05 Hz cinque volte), mentre l&#39;illuminazione il tessuto con luce blu 470-490 nm e catturare sopra 515 nm. Assicurarsi che l&#39;immagine non è né dio scuro, né spente vedi figura 3 colonna sinistra per riferimento. Nota: il tempo Collection, frequenza di raccolta, e la frequenza di stimolazione possono essere modificate per soddisfare l&#39;esperimento, il programma personalizzato incluso nel materiale supplementare può essere modificata in quanto tale. </li><li> Esportare immagini da Matlab, e utilizzando il programma scritto personalizzato disponibile in materiali supplementari per analizzare spettrale di potenza delle immagini a 0,05 Hz. L&#39;immagine risultante mostrerà percorsi collegati. Nota: Il programma personalizzato utilizza una trasformata di Fourier dei valori dei pixel nella serie storica per produrre l&#39;immagine. </li></ol></li><li> Preparazione per l&#39;imaging del calcio. <ol><li> Preparare piccola camera di incubazione con un piatto di coltura 3 centimetri e la membrana cultura sollevato per consentire aCSF di raggiungere sia la parte superiore e inferiore della fetta, e posto su una piastra elettrica per mantenere la temperatura a circa 32 ° C. </li><li> Riempire piccola camera di incubazione con aCSF caldo e lentamente la bolla con il 95% O2/5% di CO 2. </li><li> Mescolare 2 ml di acido Pluronic F-127 e 50 microgrammi di Fura-02:00 sciolto in 48 ml di DMSO. </li><li> Luogo fetta piccola camera di incubazione sulla membrana rialzato e con cura utilizzando una micropipetta aggiungere miscela colorazione direttamente sopra la MGB (o altra struttura di interesse). </li><li> Coprite le fette per prevenire lo sbiancamento prima di imaging, e permettono fette di incubare per 45 minuti - 1 ora. </li><li> Rimuovere le fette della camera di tenuta riscaldato per 10-15 minuti per lavare via il materiale in eccesso. </li><li> Seguire i passaggi da 4.1.1 a 4.1.6 per la preparazione di stimolare e immagine la fetta colliculo-talamo-corticale. </li></ol></li><li> Calcium acquisizione dell&#39;immagine. <ol><li> Raccogliere le immagini a 10 Hz (con un obiettivo ad immersione 20X acqua) per 25 sec stimolando elettricamente (ogni stimolazione è costituito da un impulso 2 msec) tessuto a 0,2 Hz cinque volte mentre illumina il tessuto con 365 luce nm e catturare la fluorescenza sopra 510 nm. </li&gt; <li> Esportare immagini da Matlab e utilizzando il programma scritto personalizzato disponibile in materiali supplementari per analizzare spettrale di potenza delle immagini a 0.2 Hz. L&#39;immagine risultante mostrerà cellule attive. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. 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Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. 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Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Nel sistema uditivo, anche se vi è sostanziale elaborazione di informazioni tra la periferia sensoriale e collicolo inferiore, vi è una notevole ulteriore elaborazione prima che raggiunga la corteccia uditiva. Sappiamo molto poco su come che l&#39;elaborazione è fatto e quindi poco su come queste trasformazioni permette al cervello di interpretare le informazioni sensoriali in entrata. Con l&#39;eccezione dell&#39;olfatto, ognuno dei sensi ha un&#39;organizzazione molto simile con segnali periferici inizialmente inoltrato ad alta fedeltà che diminuisce all&#39;aumentare del segnale di sale alla corteccia. La corteccia invia proiezioni alle strutture inferiori per modulare ulteriormente le informazioni in entrata. Questo complesso sistema è stato studiato in una varietà di modi in vivo così come in un certo numero di preparati in vitro. Nel primo caso, tutte le connessioni sono intatte, consentendo al ricercatore di sondare qualsiasi insieme di collegamenti, controllando l&#39;input sensoriale e misurandouscita in una determinata area. Con questo approccio, non vi è poco o nessun controllo della grande varietà di altri fattori, inclusi altri input sensoriali, eccitazione, e attenzione, dando luogo ad una uscita intensamente complesso. In vitro, fettine cerebrali sono stati tagliati per catturare un singolo set di proiezioni, o due aree cerebrali connesse, che permettono ai ricercatori di stimolare e valutare afferenze o aree cerebrali diverse. Si tratta spesso di fette o talamocorticali o tectothalamic in cui o l&#39;ingresso al talamo o il talamo e la sua uscita alla corteccia sono conservati 2-5. Queste preparazioni consentono un&#39;ampia varietà di manipolazioni farmacologiche, elettrici, e optogenetic. Tuttavia con solo due regioni del cervello, essi sono principalmente valutano il trasferimento di informazioni e non hanno la capacità di valutare la trasformazione delle informazioni che passa attraverso il talamo. Anche la proiezione reticolo-talamo, che possono svolgere un ruolo nella modulazione attenzione 6-9 è prESENT in questa fetta. Qui mostriamo miglioramenti su nostra precedente preparazione 1, che permette il controllo investigatore di vari ingressi al talamo di dare una prospettiva unica di come le porte talamo e filtri informazioni. Abbiamo paio questo romanzo preparazione fetta con immagini flavoproteina autofluorescenza per valutare la connettività fetta e l&#39;analisi di attivazione su larga scala, l&#39;imaging calcio nel talamo per neuronale analisi di popolazione, e la registrazione singola cellula per misurare l&#39;impatto dei vari ingressi su un livello di singola cellula. Per aiutare a mantenere queste connessioni diffuse abbiamo anche sviluppato una serie di modifiche del normale ancoraggio fetta (alias &quot;arpa&quot;) per la tenuta della fetta cervello in luogo e un ponte di elevare la fetta per una migliore perfusione. L&#39;arpa è stato progettato in un ferro di cavallo modificata per circondare la fetta e consentire punti di fissaggio personalizzabili per le corde dell&#39;arpa. Tre stringhe sonoallegata tale che i) uno si trova orizzontalmente lungo il bordo mediale della fetta, ii) uno estende dal bordo caudale del IC all&#39;estremità caudale della CA e iii) uno estende diagonalmente dal bordo mediale della fetta un&#39;area rostrale alla CA (vedere Figura 1A). Piccoli tacche del telaio per incollaggio (con colla cianoacrilato) dell&#39;arpa stringhe permettono una ridotta quantità di pressione sulla fetta per aiutare a mantenere l&#39;integrità fetta (vedere Figura 1B). Utilizzando stampa tridimensionale, possiamo arpe progettazione personalizzata alle nostre specifiche uniche, così come i ponti che consentono il flusso ideale di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) sopra e sotto il tessuto. Questo mantiene anche ampie aree per la luce di penetrare il tessuto per la patch clamp elettrofisiologia.

<table><tbody><tr><td>High sucrose cutting solution</td><td></td><td></td><td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 11.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Low calcium aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>Large culture dish</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm culture dish</td></tr><tr><td>Small culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm culture dish</td></tr><tr><td>Raised culture membrane</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td></tr><tr><td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&amp;ndash;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&amp;nbsp; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td></tr><tr><td>Calcium imaging fluorescence cube</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission</td></tr><tr><td>Agar for blocking brain</td><td></td><td></td><td>3% by weight in water</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Un esempio della fetta cervello di topo colliculo-talamocorticale ottenuta nel topo P15 è mostrata in figura 2. La fetta ideale conterrà i quattro principali strutture uditive mesencefalo e prosencefalo IC, MGB, TRN, e AC, che sono tutti attivati ​​quando il circuito integrato è stimolata (Figura 2A). Utilizzando l&#39;analisi di Fourier, la potenza spettrale viene misurato alla frequenza di stimolazione elettrica, con regioni cerebrali collegate mostrano attivit...

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Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

L&#39;utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive.

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Views.  University of Illinois Urbana-Champaign.  L'utilizzo di più angoli per tagliare il cervello di topo cucciolo, miglioriamo su una fetta cerebrale acuto precedentemente descritto, che cattura le connessioni tra le maggiori strutture mesencefalo e proencefalo uditive. 

Video: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Ricerca

Neuroscienze

Cerebrovascular Casting of the Adult Mouse for 3D Imaging and Morphological Analysis

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). Animal models are necessary for studying the etiopathology and potential therapies of cerebrovascular diseases. Imaging the vasculature in large animals is relatively easy. However, developing vessel imaging methods of murine brain disease models is desirable due to the cost and availability of genetically-modified mouse lines. Imaging the murine cerebral vascular tree is a challenge. In humans and larger animals, the gold standard for assessing the angioarchitecture at the macrovascular (conductance) level is x-ray catheter contrast-based angiography, a method not suited for small rodents.
In this article, we present a method of cerebrovascular casting that produces a durable skeleton of the entire vascular bed, including arteries, veins, and capillaries that may be analyzed using many different modalities. Complete casting of the microvessels of the mouse cerebrovasculature can be difficult; however, these challenges are addressed in this step-by-step protocol. Through intracardial perfusion of the vascular casting material, all vessels of the body are casted. The brain can then be removed and clarified using the organic solvent methyl salicylate. Three dimensional imaging of the brain blood vessels can be visualized simply and inexpensively with any conventional brightfield microscope or dissecting microscope. The casted cerebrovasculature can also be imaged and quantified using micro-computed tomography (micro-CT)1. In addition, after being imaged, the casted brain can be embedded in paraffin for histological analysis.
The benefit of this vascular casting method as compared to other techniques is its broad adaptation to various analytic tools, including brightfield microscopic analysis, CT scanning due to the radiopaque characteristic of the material, as well as histological and immunohistochemical analysis. This efficient use of tissue can save animal usage and reduce costs. We have recently demonstrated application of this method to visualize the irregular blood vessels in a mouse model of adult BAVM at a microscopic level2, and provide additional images of the malformed vessels imaged by micro-CT scan. Although this method has drawbacks and may not be ideal for all types of analyses, it is a simple, practical technique that can be easily learned and widely applied to vascular casting of blood vessels throughout the body.

In this article, we present a simple, practical technique for cerebrovascular casting that is easy to perform and can be utilized to image the vascular tree of the adult mouse brain.

Casting cerebrovascolare del topo adulto per l&#39;imaging 3D e analisi morfologica

Vascular imaging is crucial in the clinical diagnosis and management of cerebrovascular diseases, such as brain arteriovenous malformations (BAVMs). ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Corticale multistrato Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Comportamento

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Imaging a due fotoni e calcio ad ampio campo nel collicolo superiore

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autore in primo piano: Svelare la codifica neurale e i meccanismi di elaborazione visiva nel collicolo superiore 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Modifica di un Colliculo-talamo-corticale mouse Cervello Fetta, Incorporando stampa 3-D della Camera componenti e multi-scala Optical Imaging

Riepilogo

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Imaging cronica di mouse corteccia visiva Utilizzando un Assottigliato-teschio di preparazione

Casting cerebrovascolare del topo adulto per l'imaging 3D e analisi morfologica

Corticale multistrato Ca

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Un metodo di compensazione dei tessuti per l'imaging neuronale dalle scale mesoscopiche a quelle microscopiche

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo