L'imaging CSOM in fotometria in fibra combina indicatori personalizzati geneticamente codificati e fibre ottiche per monitorare l'attività neurale in animali che si muovono liberamente. Che è fondamentale per capire come uno specifico gruppo di neuroni gioca nel dirigere o rispondere a un'azione o uno stimolo. Questa tecnica è un modo accessibile per registrare da specifiche regioni cerebrali che sono definite dalla loro connessione o profili genetici, con il controllo incorporato per separare il segnale al rumore.
A dimostrare il processore sarà, Ekaterina Martianova, una studentessa laureata nel mio laboratorio. Inizia allentando tutte le viti sul traduttore a cinque assi. Avvitare il cavo patch all'adattatore apposto sul traduttore a cinque assi.
Quindi accendere la luce di eccitazione di 470 nanometri a bassa potenza e posizionare la punta della fibra indicando uno scivolo di plastica auto fluorescente. Prossimo record dal semiconduttore di ossido di metallo gratuito o dalla fotocamera CMOS in modalità live. Aumentare il guadagno o regolare la tabella di ricerca fino a quando l'immagine non è visibile nel punto focale dell'obiettivo.
Avanzare il traduttore a cinque assi verso l'obiettivo garantendo che la luce di 470 nanometri sia centrata sulla fibra all'estremità SMA o FC del cavo patch, fino a quando un'immagine può essere risolta sulla fotocamera. Infine, regolate gli assi X e Y fino a quando l'immagine non è centrata e ben risolta. Visualizza la luce emessa dall'estremità variola del cordone patch, in quanto dovrebbe apparire come un cerchio isotropo.
Inizia accendendo tutte le luci di eccitazione per visualizzare meglio le fibre. E regolare la fotocamera guadagna in modo che nessun pixel sia saturo, e un'immagine chiara delle fibre sono presenti. Quindi scatta un'immagine preliminare.
Disegna regioni di interesse o ROIS intorno alle fibre. E conservarli per la misurazione dei valori di intensità medi durante le registrazioni. Per più registrazioni in fibra, testare gli indipendenti registrando dal vivo da tutte le fibre.
Puntare una fibra verso una sorgente luminosa e toccare con un dito. Osservare le fluttuazioni nel canale. Quindi applicare il nastro colorato all'estremità delle fibre per etichettare quale ROI corrisponde a quale fibra.
Infine, impostare l'area di registrazione appendendo il cavo patch sopra l'arena utilizzando supporti, morsetti e supporti. Infine, assicurati che l'animale non sia limitato nel movimento dalla lunghezza della fibra e possa muoversi liberamente in tutta l'arena. Inizia ispezionando l'estremità distale delle fibre del cordone oculare e con un mini microscopio in fibra.
Se la superficie delle fibre è graffiata, ri-lucidare le fibre utilizzando pellicola di lucidatura in fibra con grana fine. Quindi pulire le estremità distali del cavo patch con il 70% di etanolo e un applicatore a punta di cotone. Pulire le cannule in fibra ottica utilizzando il 70% di etanolo e un applicatore a punta di cotone.
Collegare l'estremità variola del cavo patch alla fibra impiantata utilizzando una manica divisa in ceramica coperta da un tubo termoretraibile nero. Durante la connessione, assicurarsi che la manica sia stretta. Lasciare che l'animale si riprenda per alcuni minuti.
Quindi inizia a registrare il segnale ottico ed esegui l'esperimento. Durante la registrazione tieni d'occhio la traccia dal vivo per garantire registrazioni di qualità. E guarda eventuali salti nel segnale, indicando che la manica non è abbastanza stretta.
Per le registrazioni a doppio colore, aggiungere un LED da 516 nanometri al sistema di fotometria per eccitare il sensore di calcio fluorescente rosso e adeguati specchi e filtri dicroici. Quindi aggiungi uno splitter di immagini tra l'obiettivo e la fotocamera CMOS per separare le lunghezze delle onde di emissione verdi e rosse. Infine, disegna ROIS intorno a tutte le fibre in entrambi i colori, rosso e verde.
Assicurati di identificare chiaramente ogni ROI con la fibra e il canale corrispondenti. Attiva l'eccitazione simultanea con LED da 470 nanometri e 560 nanometri e alternali a un LED da 410 nanometri. I risultati indicano che la fluorescenza misurata è aumentata significativamente in concomitanza con la somministrazione di sbuffi d'aria per topi con attivazione della via LHA-LHB.
Tuttavia, nei topi che esprimono proteine fluorescenti verdi o GFP, non è stato rilevato alcun cambiamento nel segnale durante la somministrazione di sbuffi d'aria. Questa tecnica consente ai ricercatori di registrare ragionevolmente da specifici tipi di cellule in diverse regioni cerebrali. Mentre un animale si comporta liberamente.
Questo ulteriormente la capacità di sezionare le funzioni di queste regioni cerebrali in relazione al comportamento.
