Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biochimica, come la modifica proteolitica delle proteine, così come la caratterizzazione di inibitori e proteasi e peptidasi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente un rapido screening dell'attività proteolitica delle proteasi sui peptidi, rappresentando il lato di scissione della proteina data. L'uso qui è quello di studiare le proteasi che attivano la fusione virale.
Il primo passo nella progettazione peptidica è quello di acquisire la sequenza della proteina di fusione di interesse da un database pubblico come NCBI o il database di agenti patogeni virali. Scegli il sito di riconoscimento della proteasi procedendo con il peptide di fusione e includi da due a tre amminoacidi a monte e a valle di questa sequenza. Quando si ordina il peptide, modificarlo con il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza o la coppia FRET, Mca al capolinea finale e Dnp al capolinea c.
Durante il saggio, Mca è eccitato ed emette energia luminosa che viene spenta da Dnp finché la coppia è in prossimità l'una dell'altra. Tuttavia, se si verifica una scissione, Dnp non sarà in grado di spegnere l'emissione che può quindi essere letta dal lettore di piastre a fluorescenza. Riprendono il peptide secondo le raccomandazioni dei produttori tubazionando delicatamente su e giù.
Ad esempio, resuspend in 70%etanolo ad una concentrazione finale di un millimolare. Se il peptide non si rimospende molto bene con la pipettazione, posizionare il tubo contenente il peptide e il solvente in un bagno di sonicazione fino a quando non viene completamente rimorsi. Distribuire 100 aliquote microliter del peptide in tubi leggeri di smorzamento o resistenti per proteggere il peptide dallo sbiancamento.
Conservare le aliquote a meno 20 gradi Celsius. Iniziare questa procedura accendendo il lettore di lastre e aspettando fino al termine dell'autotest. Quindi, aprire il software operativo sul computer collegato e assicurarsi che sia collegato al lettore di piastre.
Aprire l'impostazione della temperatura e impostarla sulla temperatura richiesta per prestazioni ottimali per la proteasi, che è di 30 gradi Celsius, in questo caso. Per impostare l'esperimento, fare clic sulla configurazione dello strumento di controllo, scegliere cinetico e quindi selezionare fluorescenza. Immettere una lunghezza d'onda di eccitazione di 330 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 390 nanometri.
Deselezionate il taglio automatico e selezionate la sensibilità medio/normale. Scegli un tempo di esecuzione di un'ora per il saggio e seleziona una misurazione ogni 60 secondi. Impostare cinque secondi di miscelazione prima della prima misurazione e tre secondi prima di ogni misurazione.
Infine, selezionare i pozzi da leggere. Preparare i tamponi di dosaggio appropriati per le proteasi come descritto nel protocollo di testo e raffreddare i tamponi sul ghiaccio. Posizionare una piastra solida in polistirolo nero non trattato a 96 poggiale sul ghiaccio con una sottile piastra metallica sottostante per supportare il raffreddamento e la stabilità.
È essenziale utilizzare una piastra nera come piastra di dosaggio, per evitare perdite fluorescenti da pozzi adiacenti. Per peptide, preparare tre repliche tecniche per saggio e un volume totale di 100 microlitri per campione. Pipettare la quantità appropriata di tampone di dosaggio in ogni pozzo della piastra di dosaggio.
Aggiungere 0,5 microlitri di proteasi ad ogni pozzo. A sei pozzi, aggiungere 0,5 microlitri di tampone invece della rispettiva proteasi. Tre di questi saranno controlli ciechi e gli altri tre saranno controlli peptidici.
Aggiungere cinque microlitri del peptide a una concentrazione finale di 50 micromolari ad ogni pozzo, ad eccezione dei controlli ciechi. A ciascuno dei tre pozzi di controllo ciechi, aggiungere cinque microlitri di tampone invece del peptide. Inserire il piatto nel lettore di lastre flourescents e fare clic su avvia.
Prima di avviare l'analisi dei dati, salvare il file dell'esperimento. Fare clic sull'esportazione ed esportare il file come txt. Importare il file txt in un foglio di calcolo.
Iniziate l'analisi creando un grafico, tracciando le unità fluorescenti relative sull'asse y rispetto al tempo sull'asse x per ogni replica tecnica per campione. Selezionare l'intervallo di dati in cui il grafico si trova in un intervallo lineare e il più vicino all'inizio dell'aumento della fluorescenza. Tracciate i dati selezionati su un secondo grafico e aggiungete una linea di tendenza lineare.
Nelle opzioni della linea di tendenza selezionare Visualizza equazione nel grafico. L'equazione mostrerà V max, che corrisponde alla pendenza della linea di tendenza. Calcolare il valore medio V max per ogni campione dalle tre repliche tecniche.
Dopo aver ripetuto l'esperimento altre due volte, per ottenere tre repliche biologiche, calcolare la deviazione standard in base ai dati delle tre repliche biologiche indipendenti. Un saggio di scissione furina del coronavirus MERS umano, del sito principale EMC/2012 S2 e del ceppo doppio mutante derivato dal cammello HKU205, insieme alle singole varianti mutanti di EMC/2012, ha rivelato che il peptide EMC/2012 è stato efficacemente scisto, mentre quasi nessuna scissione del peptide primario S2 di HKU205 si è verificata. La scissione del peptide primario S2 mutato da A-S/2012 È stata fortemente ridotta e non c'è stata quasi alcuna scissione del peptide primario DA EMC/2012 S a I mutato S2.
Un altro saggio di scissione della furina ha mostrato solo una scollatura minima del sito principale Marocco 213 S2 derivato dal cammello, rispetto al coronavirus MERS umano, sito principale EMC / 2012 S2. La scissione della furina è stata osservata per il peptide prototipo S1/S2, FECV I e 4 S1/S2, ma non nel peptide S1/S2 mutato, FIPV I Black S1/S2. Allo stesso modo, furin fu in grado di scindere il peptide primario S2 prototipo, FECV II 1683 S2 prime, ma non i peptidi primi S2 mutati, FECV I e 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime e FIPV II 1146 S2 prime.
Seguendo questa procedura, l'analisi western della macchia o i saggi di ammino-fluorescenza, utilizzando la proteina a tutta lunghezza di interesse possono essere eseguiti per verificare la scissione proteica, o in questo caso, se la scissione si traduce in una versione fusogena della proteina di fusione virale.
