Le attuali tecniche zigografiche rilevano un numero limitato di proteasi. La zimografia peptidica fluorescente utilizza peptidi fluorescenti come substrato degradabile consentendo la misurazione di una maggiore gamma di proteasi. Il vantaggio principale di questo metodo è il suo design modulare.
La sequenza del peptide fluorescente determina quali proteasi vengono rilevate e il peptide fluorescente può essere facilmente scambiato con un peptide di una sequenza diversa, una capacità di rilevare altre proteasi. Questa tecnica può aiutare a informare la progettazione dell'uso dei peptidi come cross-linker degradabili in biomateriali ingegnerizzati come quelli utilizzati per la somministrazione di farmaci o applicazioni di ingegneria tissutale. L'incorporazione di questo peptide in questa tecnica può identificare le proteasi secrete dai tessuti che sono responsabili della degradazione dei biomateriali.
La dimostrazione di questa tecnica è importante per visualizzare l'approccio multistrato unico rispetto ad altre tecniche di zimografia. A dimostrare questa tecnica sarà, Ameya Deshmukh, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% di poliacrilammide come descritto nella tabella uno del protocollo di testo.
Immediatamente prima di versare il gel, aggiungere il TEMED e l'APS. Quindi, riempire e svuotare la mini cassetta gel da 1,5 millimetri a metà strada con la soluzione di gel risolutivo. Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle.
Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando la poliacrilammide nel tubo ha completamente solidificato la reazione è completa. Mentre il primo strato di gel risolutivo è la polimerizzazione, recuperare il kit Azido-PEG3-Maleimide dallo stoccaggio a 20 gradi Celsius e consentire ai componenti di raggiungere la temperatura ambiente.
Quindi, sciogliere i componenti della fiala due nel volume raccomandato dal produttore di DMSO. E vortice per 30 secondi per garantire che i liquidi siano ben miscelati. Trasferire il contenuto di una fiala in un pallone inferiore rotondo pulito e asciutto da 100 milliletteri che contiene una barra di agitazione.
Inserire immediatamente un tappo di setto di gomma con un diaframma che può essere perforato con una siringa nella bocca del pallone. Quindi, inserire due aghi per siringhe calibro 18 nel diaframma. Collegare uno degli aghi della siringa a un serbatoio di gas inerte e consentire al gas di riempire il pallone inferiore rotondo per tre minuti.
Quindi, spegnere il gas inerte e staccarlo dall'ago. Usando una siringa, iniettare l'intero contenuto del flaconcino due nel pallone. Rimuovere entrambi gli aghi e la siringa.
Lasciare mescolare i componenti per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'agitazione. Dopo questo rimuovere il tappo del setto di gomma e trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga pulito da cinque millilitri. Una volta che il primo strato di gel risolutivo ha polimerizzato versare lo strato di isopropanolo.
Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Recuperare il peptide fluorescente funzionalizzato al tiolo dallo stoccaggio a 80 gradi Celsius. Lasciare scongelare a temperatura ambiente.
Preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% contenente la molecola del linker Azido-PEG3-Maleimide e il peptide fluorescente come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Quindi, riempire metà della porzione rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel risolutivo peptidico.
Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, versare lo strato isopropanolo.
Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Se non si utilizzano immediatamente i gel, conservarli immergendoli in una scatola di plastica piena di 100 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius. Avvolgere la scatola in un foglio di alluminio per evitare il fotobleaching.
Preparare innanzitutto una soluzione gel di impilamento del 5% come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Riempire la porzione vuota rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel impilamento.
Inserire rapidamente un pettine di gel da 1,5 millimetri nello strato di gel impilamento assicurandosi che non rimangano bolle intrappolate sotto i pozzi. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, rimuovere delicatamente il pettine e il nastro dal retro della cassetta di gel.
Per iniziare, sciogliere i campioni nel buffer del campione di zimografia convenzionale. Aggiungere 400 millilitro os 1X tris glicenico SDS running buffer all'apparato gel. Caricare fino a 35 microlitri di campione per pozzo.
Eseguire i campioni a 120 volt a quattro gradi Celsius per un'ora e mezza o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse si trovano all'interno dello strato di gel che risolve i peptidi. Dopo questo, rimuovere i gel dalla cassetta di plastica. Lavare i gel tre volte in tampone di ri-naturing a temperatura ambiente sotto delicata agitazione.
Ad ogni lavaggio, della durata di 10 minuti. Trasferire i gel in una soluzione tampone in via di sviluppo per 15 minuti. Quindi sostituire la soluzione con un tampone di sviluppo fresco e incubare a 37 gradi Celsius sotto delicata agitazione per 24 ore.
Successivamente, utilizzare un imager dello scanner di gel fluorescente con i filtri di eccitazione ed emissione appropriati per l'immagine dei gel. In questo studio alla proteasi fluorescente i peptidi degradabili sono incorporati nei gel di poliacrilammide. QGIW è una sequenza derivata dal collagene progettata per rilevare la collagenesi cellulare, mentre LACW è una sequenza ottimizzata per il rilevamento di MMP-14 e MMP-11.
L'imaging fluorescente rivela numerose bande all'interno dei gel peptidici LACW, mentre solo una singola banda è vista nei gel QGIW. Rispetto alla zimografia della gelatina, i gel LACW sono in grado di rilevare più bande proteolitiche, il che dimostra la capacità della zimografia peptidica di rilevare una gamma più ampia di proteasi presenti all'interno di campioni biologici rispetto ai metodi tradizionali che utilizzano substrati nativi. Le cellule nemografiche peptidiche vengono quindi incubate in un tampone di sviluppo contenente GM6001, un inibitore dell'MMP ad ampio spettro, o E64, un inibitore generale della catesina.
Il trattamento dei gel peptidici LACW con GM6001, diminuisce l'intensità delle bande. Mentre il trattamento con E64 non ha alcun effetto percepibile. Il trattamento dei gel peptidici QGIQ con GM6001 si traduce in una completa ablazione delle bande precedentemente viste.
Mentre E64 non ha alcun effetto. La zimografia della gelatina viene condotta utilizzando MMP-9 purificato e attivato per confrontare la sensibilità della zimografia peptidica con l'attuale gold standard. I gel LACW sono in grado di rilevare le concentrazioni più piccole di MMP-9.
Le proteasi richiedono condizioni specifiche per riprotersi e attivarsi. Preparare con cura le soluzioni tampone per garantire che la composizione e il PH siano corretti. Questo metodo può essere integrato dalle tecniche esistenti per verificare l'identità ed eseguire ulteriori analisi delle proteasi misurate.
Ciò include l'assorbimento occidentale, la PCR in tempo reale e la spettrometria di massa. Fare attenzione quando si maneggia poliacrilammide. La soluzione non ipnotizzata è considerata una potente neurotossina e i dispositivi di protezione individuale appropriati devono sempre essere indossati durante la manipolazione.
