Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R01HL105826 e K02HL114749 (Dr. Sadayappan), e American Heart Association Midwest Fellowships; 11PRE7240022 (Mr. Barefield) e 13POST14720024 (Dr. Govindan). Gli autori ringraziano l&#39;assistenza del dottor Jimmy Page, Jill Clampit e Dr. John Hudson, MSD, per la loro eccellente supporto tecnico e la letteratura nello sviluppo del test.

1. Uniplex cMyBP-C Assay <ol><li> Il giorno prima dell&#39;esperimento, cappotto della piastra standard nuda a 96 pozzetti MSD con anticorpo di cattura. Per cMyBP-C, utilizzare un volume 30 pl di topo monoclonale anti-cMyBP-C (gelatina libero) ad una concentrazione di 5 mg / ml diluito in tampone fosfato (PBS). </li><li> Poiché il pozzo è idrofobo, pipettare la soluzione nel angolo inferiore del pozzo; toccare i lati della piastra di diffondere la soluzione su tutta bene. </li><li> La piastra è rivestita con un adesivo ed incubata O / N a 4 ° C senza agitazione. </li><li> Rimuovere la soluzione di anticorpo di cattura toccando la soluzione fuori sopra un lavandino e poi su una pila di tovaglioli di carta. Legame non specifico alla piastra è bloccata con l&#39;aggiunta di 150 pl di un 5% (w / v) Una soluzione bloccante (alta qualità BSA) in PBS ad ogni pozzetto. </li><li> Sigillare la piastra e incubare per 1 ora a temperatura ambiente sotto agitazione a 700 rpm. </li><li> Durante la fase di bloccaggio, preparare gli standard e samples. Rendere la serie standard diluendo frammento ricombinante proteina cMyBP-C (amminoacidi 1-271) ad una concentrazione iniziale di 2,000 ng / ml in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Poi diluire serialmente di un fattore 5 in 1% (w / v) bloccante A / PBS. Totale di 7 standard + 1 blank (1% (w / v) bloccante A / solo PBS) sono stati utilizzati. </li><li> Rimuovere la soluzione di saturazione e lavare la piastra 3 volte con 150 microlitri 0,05% (v / v) Tween-20/PBS. Ogni volta, rimuovere la soluzione di lavaggio invertendo la piastra sopra un lavandino. Dopo la terza fase di lavaggio, con forza flick la piastra sopra un lavandino e Pat la piastra energicamente su uno strato di asciugamani di carta fino a quando non è completamente asciutto. Questo è un punto cruciale, come volumi di incubazione sono piccole, e la soluzione di lavaggio restante sarà diluire significativamente la prossima incubazione. </li><li> Pipettare 25 ml di standard e campioni nei pozzetti. Sigillare la piastra e incubare a temperatura ambiente, agitando a 700 rpm per 1 ora. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo di rilevazione a 1 mg / ml in 1% bloccante A / PBS. A custom fatto cMyBP-C anticorpi (epitopi aminoacidi 2-14) con MSD SULFO-TAG etichettatura serve come l&#39;anticorpo di rilevazione. I kit sono disponibili per l&#39;etichettatura SULFO-TAG, che lo rende una procedura relativamente semplice per etichettare qualsiasi anticorpo. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4. </li><li> Aggiungere 25 ml di soluzione di anticorpo di rilevazione per ciascun bene, sigillare la piastra ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora su un agitatore impostato a 700 rpm. </li><li> Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software (vedi sezione reagente). Inoltre, diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x lettura-buffer a 15 ml di acqua distillata. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio come descritto al punto 1.4. </li><li> Aggiungere 150 ml di lettura del buffer di ogni bene usando una pipetta multicanale. Essere sicuri di evitare bolle d&#39;aria (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l&#39;aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nel SettoreImager. </li></ol> 2. 3-plex cMyBP-C, CK-MB e cTnI Assay <ol><li> A soluzioni di 96 pozzetti 3-plex e diluente sono autorizzati a stabilizzare a RT prima dell&#39;uso. Questo piatto è pre-rivestita con anticorpi di cattura per cMyBP-C, CK-MB e cTnI da MSD. </li><li> Aggiungere 25 ml di 1% (w / v) bloccante A / PBS ad ogni pozzetto. Toccare i lati della piastra per assicurarsi che l&#39;intera ben è coperto da soluzione. </li><li> Sigillare la piastra con un foglio sigillante, collocare la piastra su un agitatore, e agitare a 700 rpm per 30 min. </li><li> Nel frattempo, viene preparata una serie di diluizioni di singoli calibratori. Poiché ogni bene ha tre anticorpi di cattura tre calibratori devono essere miscelati e diluiti serialmente prima dell&#39;uso. Diluire ricombinante cMyBP-C, CK-MB (MSD), e cTnI (MSD) insieme in 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare un campione con 2.000 ng / ml cMyBP-C, 100 ng / ml CK- MB, e 25 ng / ml di cTnI (campione A). </li><li> Un volume finale di almeno 100 microlitri viene preparato per ciascuno standard. Acompletano la serie standard, serie diluire i campioni sono di un fattore 5. Utilizzare 25 microlitri del campione A in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione B. Quindi utilizzare 25 microlitri di campione B in 100 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS per creare campione C e così via. Campioni di siero umano di 16 soggetti con infarto miocardico e 16 soggetti di controllo sono stati usati per misurare i livelli di cTnI cMyBP-C, CK-MB e. Questi campioni sono stati diluiti in 2x 1% (w / v) bloccante A / PBS. </li><li> Aggiungere 25 ml di standard e di campione diluito al 25 microlitri già presente nei pozzetti della piastra 3-plex. È importante anche includere uno spazio (solo diluente). Di stabilire la tecnica, i campioni vengono caricati in triplicato tecnici. In caso contrario, i duplicati sono sufficienti. </li><li> Sigillare nuovamente la piastra (sigillante può essere riutilizzato) e incubare su un agitatore (700 rpm) a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Appena prima l&#39;incubazione è terminata, la soluzione di anticorpo di rivelazione è preparato. Il diluente utilizzato è 1% (w / v) Un bloccante in PBS. Tutti thranticorpi di rivelazione ee SULFO-tag vengono diluiti insieme in una concentrazione finale di 1 mg / ml ciascuno. Anticorpi di rilevamento sono di norma forniti a una concentrazione magazzino 50x. </li><li> Per una completa piastra a 96 pozzetti, è necessaria 2,700 ml di soluzione totale diluita (con pipettaggio errore inclusa). Aggiungere 54 ml di ogni anticorpo di rilevazione 2.538 microlitri 1% (w / v) bloccante A / PBS. </li><li> Dopo 2 ore, togliere le soluzioni da vigorosamente sfogliando la piastra sopra un lavandino. Lavare i pozzetti 3 volte con 150 ml di 0,05% Tween-20 in PBS. Aggiungere 25 microlitri di soluzione di anticorpo di rilevazione ogni pozzetto usando una pipetta multicanale, ei lati della piastra sono nastrate per assicurare che l&#39;intera ben è coperto da soluzione. </li><li> Sigillare la piastra e incubare per 1 ora agitando a 700 giri al minuto. </li><li> Durante il periodo di incubazione, eseguire MSD di demo-piastra (piastra con luci a LED) per garantire il corretto funzionamento del Imager Settore e del software. Anche diluire la lettura del buffer, che è fornito da MSD, aggiungendo 5 ml di 4x letturatampone a 15 ml di acqua distillata. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 2.8. </li><li> Aggiungere 150 ml di buffer di lettura ad ogni pozzetto usando una pipetta multicanale. Evitare bolle d&#39;aria è fondamentale (pipettaggio inverso è un metodo adeguato). Dopo l&#39;aggiunta della lettura del buffer, eseguire la scansione immediatamente la piastra nella Imager Settore. </li></ol>

<ol>
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Sci. 63, 879-884 (2008).</li><li>Thompson, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+electrochemiluminescence+wash+and+no-wash+immunoassays+for+detection+of+serum+antibodies+to+smooth+Brucella+strains.">Competitive electrochemiluminescence wash and no-wash immunoassays for detection of serum antibodies to smooth Brucella strains.</a> Clin. Vaccine Immunol. 16, 765-771 (2009).</li><li>Kingsmore, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+measurement:+technologies+and+applications+of+protein+and+antibody+arrays.">Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 5, 310-320 (2006).</li><li>Altan, Z. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+redefining+its+structure+and+function.">Cardiac myosin binding protein-C: redefining its structure and function.</a> Biophys. Rev. 4, 93-106 (2012).</li><li>Sadayappan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myosin+binding+protein-C:+a+potential+early-stage,+cardiac-specific+biomarker+of+ischemia-reperfusion+injury.">Cardiac myosin binding protein-C: a potential early-stage, cardiac-specific biomarker of ischemia-reperfusion injury.</a> Biomark Med. 6, 69-72 (2012).</li><li>Fichorova, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+and+technical+variables+affecting+immunoassay+recovery+of+cytokines+from+human+serum+and+simulated+vaginal+fluid:+a+multicenter+study.">Biological and technical variables affecting immunoassay recovery of cytokines from human serum and simulated vaginal fluid: a multicenter study.</a> Anal. Chem. 80, 4741-4751 (2008).</li><li>Malekzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+multi-plex+and+mono-plex+platforms+for+the+discovery+of+inflammatory+profiles+in+neurodegenerative+diseases.">Challenges in multi-plex and mono-plex platforms for the discovery of inflammatory profiles in neurodegenerative diseases.</a> Methods. 56, 508-513 (2012).</li></ol>

Un&#39;applicazione completa di brevetto è in corso (Applicazione di serie n ° 13/464, 466, Pub No. US 2012/0282618 A1 e Data:. 05/04/12) per determinare i fattori di rischio connessi con il degrado cMyBP-C e il rilascio nel liquido corpo umano e quantificare il livello di cMyBP-C in fluido corporeo umano.

In questo studio, mostriamo l&#39;applicabilità di un immunodosaggio multiplex per la rilevazione di più marcatori cardiaci nel siero di pazienti. Questa tecnica presenta numerosi vantaggi rispetto tradizionale ELISA. Prima, nel kit ECL saggio è usato invece di rilevazione colorimetrica. In ECL, un segnale elettrico stimola la produzione locale di proprietà misurate (luce), quindi sganciare l&#39;evento stimolazione dal segnale, che riduce sfondo 14. Questo permette di elevata sensibilità, come si può v...

La misura di basse quantità di proteine ​​in campioni biologici complessi, quali siero, è di crescente importanza clinica per la gestione del paziente, così come la scienza di base. Per esempio, un aumento dei livelli sierici di marcatori cardiaci, quali troponina I, in un ambiente clinico è coerente con infarto acuto del miocardio (MI) 1. Per rilevare le proteine ​​in campioni di siero, saggio immunoenzimatico standard (ELISA) è la tecnica più utilizzata come ha alta sensibilità e consente la quantificazione assoluta dell&#39;analita. Tuttavia, ELISA tradizionali richiedono una quantità relativamente grande di campione (tipicamente 100 pl), hanno alta segnale di fondo in alcuni fluidi biologici, e sono limitati alla misurazione di un solo analita per ELISA 2. Recentemente, una nuova tecnica di immunodosaggio è stata introdotta che aggira molti di questi inconvenienti. Questo test modificato, sviluppato da MSD, utilizza electrochemiluminescrenza (ECL) per la rilevazione del segnale, che consente un background molto bassa e una maggiore sensibilità, consentendo l&#39;uso di piccoli volumi di campione. ElettroChemiLuminescenza è basato sulla molecola reporter rutenio (II) trisbipyridal, che è attaccato agli anticorpi di rivelazione. Questa molecola reporter emette luce a 620 nm sulla stimolazione elettrica del fondo della piastra a 96 pozzetti dotato di elettrodi di carbonio in essi integrati 3. Inoltre, utilizzando rivestimento macchia, anticorpi di cattura multipli possono essere rivestiti in un pozzetto (fino a 10 su una piastra a 96 pozzetti), consentendo la quantificazione simultanea di proteine ​​differenti in un singolo campione 4. Questa tecnica è stata recentemente utilizzata per misurare profili di citochine proinfiammatorie nel siero 5,6. Le piastre multiplex da MSD reggono bene il confronto con altre piattaforme di test multiplex 7. Utilizzando MSD come la piattaforma di riferimento primario, abbiamo ulteriormente sviluppato un custom made piatto 3-plex che cdi quantificare simultaneamente il livello di miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C), creatina-chinasi MB (CK-MB) e troponina I cardiaca (cTnI), ed i risultati sono stati confrontati con il rilevamento monoplex di cMyBP-C. CK-MB e cTnI sono biomarcatori ben consolidate per MI. Tuttavia, gli aumenti di questi marcatori possono essere causati da patologie diverse da MI, es miocardite o insufficienza renale 8. Questo sostiene l&#39;aggiunta di biomarcatori supplementari per aumentare la specificità della diagnosi di MI. Abbiamo recentemente dimostrato che cMyBP-C è anche un potenziale biomarcatore per MI 9. cMyBP-C è un filamento spesso associata proteina che è espressa nel cuore, 10-12 ma non nei muscoli scheletrici o lisci. Così, l&#39;aumento del livello di cMyBP-C nel sistema circolatorio è un indicatore specifico di danno cardiaco 13. In questo studio, abbiamo confrontato rilevamento uniplex di cMyBP-C con l&#39;uso di un saggio 3-plex personalizzato per misurare i livelli sierici dicMyBP-C, CK-MB e cTnI nel siero dei pazienti con infarto miocardico. In futuro, questa tecnica di firma può essere utilizzato per diagnosticare MI in pazienti che si presentano con dolore toracico in Pronto Soccorso. La board review istituzione (IRB) del Loyola University di Chicago ha approvato lo studio per l&#39;utilizzo di campioni umani deidentified e l&#39;uso del saggio immunologico (LU # 20392).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Read-Buffer T (4X) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R92TC-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Acros</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>R93BA-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10X</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin binding protein C antibody, mouse monoclonal (E7), gelatin free</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-137180L</td>
			<td>For coating, antibody has to be gelatin free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Plates and Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well standard plate</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>L15XA-3</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A prototype 3-plex, four-spot, 96-well plate with cMyBP-C, cTnI and CK-MB</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>N452A-1</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermaSeal Sealing Film</td>
			<td>Life Science Products Inc.</td>
			<td>ST-3098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400A</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTS 2/4 digital microtiter shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3208001</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sensitive and specific quantitation method for determination of serum cardiac myosin binding protein-c by electrochemiluminescence immunoassay

Biomarcatori stanno diventando sempre più importante nel processo decisionale clinico, così come la scienza di base. Diagnosi di infarto del miocardio (MI) è in gran parte determinata rilevando proteine ​​cardiaco-specifici nel siero o nel plasma dei pazienti come indicatore di danno miocardico. Avendo recentemente dimostrato che miosina cardiaca legame proteina-C (cMyBP-C) è rilevabile nel siero dopo MI, abbiamo proposto come potenziale biomarker per MI. Biomarcatori sono in genere rilevati dai tradizionali panino saggi immunoenzimatica. Tuttavia, questa tecnica richiede un volume di campione grande, ha una piccola gamma dinamica, e può misurare solo una proteina alla volta. Qui vi mostriamo un test immunologico multiplex in cui tre proteine ​​cardiache possono essere misurate simultaneamente con alta sensibilità. Misurare cMyBP-C in Uniplex o insieme a creatina chinasi MB e troponina cardiaca ho mostrato sensibilità paragonabile. Questa tecnica utilizza il Meso Scale Discovery(MSD) metodo di multiplazione in una piastra a 96 pozzetti combinato con ElettroChemiLuminescenza per il rilevamento. Mentre sono necessari solo piccoli volumi di campione, alta sensibilità e una grande gamma dinamica si ottengono. Utilizzando questa tecnica, abbiamo misurato cMyBP-C, creatina chinasi MB e troponina cardiaca I livelli in campioni di siero di 16 soggetti con infarto miocardico e confrontato i risultati con 16 soggetti di controllo. Siamo stati in grado di rilevare tutti i tre marcatori in questi campioni e ho trovato tutti e tre i biomarcatori per essere aumentati dopo il MI. Questa tecnica è quindi adatto per la rivelazione sensibile dei marcatori cardiaci in campioni di siero.

I principi di base e flusso del saggio 3-plex sono riportati nella Figura 1, e il flusso di lavoro complessivo è descritto nella Tabella 1. Saggi Uniplex funzionano lungo lo stesso principio, tranne che l&#39;intero fondo pozzo viene rivestito con un anticorpo di cattura. Rilevazione del segnale è fatto da ECL in cui un segnale elettrico viene applicato al fondo del pozzo. Questo, a sua volta, avvia una produzione locale di luce attraverso una reazione chimica del buffer di lettura co...

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A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

Un metodo di quantificazione sensibile e specifico per la determinazione del siero miosina cardiaca Binding Protein-C da elettrochemiluminescenza immunoenzimatico

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

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JoVE Journal

Biology

16.6K Views.  Loyola University Chicago. Biomarcatori di misura in campioni biologici complessi è sempre più guidando il processo decisionale clinico. Descriviamo un metodo altamente sensibile per misurare simultaneamente miosina cardiaca legame proteina-C, creatina chinasi MB e troponina I cardiaca in campioni di siero di soggetti con infarto miocardico e di soggetti sani di controllo.

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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR-Clip - un metodo per identificare trascrittoma livello i siti di legame delle proteine ​​RNA binding

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

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Biologia

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Un metodo per l&#39;isolamento del mouse isole pancreatiche e intracellulare cAMP Determinazione

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within the brain, ascorbate acts in a neuroprotective and neuromodulatory manner that involves ascorbate cycling between neurons and vicinal astrocytes - a relationship that appears to be crucial for brain ascorbate homeostasis. Additionally, emerging evidence strongly suggests that ascorbate has a greatly expanded role in regulating cellular and systemic iron metabolism than is classically recognized. The increasing recognition of the integral role of ascorbate in normal and deregulated cellular and organismal physiology demands a range of medium-throughput and high-sensitivity analytic techniques that can be executed without the need for highly expensive specialist equipment. Here we provide explicit instructions for a medium-throughput, specific and relatively inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Ascorbate plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. Here we describe a medium-throughput, specific and inexpensive microplate assay for the determination of both intra- and extracellular ascorbate in cell culture.

Una rapida e specifica Microplate Assay per la determinazione di ascorbato intra-ed extracellulare in cellule in coltura

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Legatura altamente efficiente delle piccole molecole di RNA per microRNA Quantificazione mediante sequenziamento High-Throughput

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procedure e strategie di ottimizzazione chiave per un metodo automatizzato Immunoassay basati su elettroforetica capillare

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...