Questo studio è stato sostenuto in parte dal NIH / NIBIB R21EB008166 di DL e NIA AG028455 e NIA AG022385 per DJM. Ringraziamo il dottor James Olson presso il Centro di Fred Hutchinson Cancer Research per aver fornito loro i topi D282 tumore.

Parte 1: Sicurezza Magnete Sia MRI e MRS usare un forte campo magnetico, che richiede estrema cautela. Ad esempio, il 4,7 T strumento che abbiamo usato per il presente lavoro ha un campo magnetico circa 90.000 volte il campo magnetico terrestre. Il campo magnetico è sempre, anche quando lo scanner RM non è in uso. Oggetti metallici che entra in contatto con un campo magnetico ad alta sarà fortemente e rapidamente attratto dalla calamita. E &#39;estremamente pericoloso se un soggetto sperimentale o operatore si trova nel percorso del proiettile di un oggetto metallico volare nel magnete. Pertanto, il personale che condurre esperimenti MR deve fare attenzione a rimuovere oggetti metallici dai loro vestiti prima di entrare nella vicinanza dello strumento e anche mantenere l&#39;ambiente circostante libero da tali oggetti. Informazioni più dettagliate sulla sicurezza magnete appare nella letteratura 1 e la seguente pagina web: <a href="http://www.imrser.org/">http://www.imrser.org/</a> . La presenza di materiale metallico non può che causare il problema di sicurezza di cui sopra, ma interferiscono con i risultati sperimentali inducendo immagini / artefatti spettroscopiche. Il presente materiale metallico vicino o dentro l&#39;oggetto di imaging possono alterare il campo magnetico in prossimità e quindi generano artefatti sulle immagini acquisite o ampliare la larghezza di riga degli spettri. Di conseguenza, lasciare portafogli, chiavi, penne, ecc al di fuori del magnete se trattare gli animali per le procedure di MR. Parte 2: In Vivo MRI del mouse in un magnete orizzontale Alesaggio Preparazione degli animali per la risonanza magnetica <ol><li> Tutte le procedure animale deve essere approvato dalla cura degli animali e il comitato istituzionale uso (IACUC) prima di eseguire qualsiasi tipo di trattamento degli animali. </li><li> Noi usiamo vaporizzato isoflurano per anestetizzare gli animali per esperimenti di risonanza magnetica. Anestesia degli animali può essere raggiunto da altri anestetici come Avertin (2,2,2-tribromoethanol o TBE) e un cocktail di ketamina e xilazina. Informazioni sul dosaggio di ogni anestetico si trova nella tabella 1. </li><li> Linea di una camera di induzione con plastica tampone assorbente sostenuta (blu o pad mandrino). Posizionare un mouse (o più topi per il multi-mouse imaging) nella camera di induzione. </li><li> Regolare il flussimetro del vaporizzatore per isofluorano 0,8 1,5 L / min. Quindi regolare il vaporizzatore isoflurano al 4% per circa 2 3 minuti. </li><li> Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia (cioè nessuna risposta pizzico tep), posizionare il mouse su un supporto animale con il naso inserito in un cono (o maschera). Un dispositivo di immobilizzazione testa può essere utilizzata per l&#39;imaging testa e un supporto del corpo può essere utilizzato per l&#39;imaging del corpo. </li><li> Detentori degli animali sono usati per impedire il movimento potenziale: ci sono diversi tipi di supporti commerciali. Inoltre, un supporto progettato su misura possono essere fabbricati per soddisfare esigenze speciali di un apparato sperimentale. Per un supporto personalizzato, assicurarsi di utilizzare solo materiale non magnetico. </li><li> Durante il periodo delle immagini, regolare il misuratore di portata a 0,4 0,8 ml / min e ridurre il vaporizzatore per isofluorano 1,2 1,5%. Il gas è scaduta proveniente dal cono del mouse viene raccolto da una pompa e rimosso in un in-house vuoto. </li><li> Gli occhi dell&#39;animale sarà tenuto umido con un unguento sterile lubrificazione dell&#39;occhio. L&#39;animale sarà mantenuto a 35-37 ° C durante l&#39;esperimento all&#39;interno di un sistema di circolazione dell&#39;acqua calda. Altri tipi di fonte di calore può essere utilizzato come pad di riscaldamento e aria calda soffiata nel (RF) bobina a radiofrequenza. </li><li> Un sistema di monitoraggio degli animali è in atto per monitorare la temperatura corporea, la respirazione / ciclo cardiaco, la respirazione e la sincronizzazione / gating cardiaco con acquisizioni di immagini. </li><li> Un campione standard in agarosio si trova accanto all&#39;animale per monitorare il cambiamento brusco del segnale. Questo esempio agar standard è particolarmente utile per il multi-slice e multi-imaging in tempo punto. Quando un segnale inaspettato cambiamento viene rilevato in una fetta dalle immagini acquisite, la fetta con la variazione del segnale inaspettato può essere eliminato. Inoltre, la sua intensità del segnale può essere regolato in base al cambiamento del segnale del campione standard durante la post-analisi delle immagini. </li><li> Dopo la messa in sicurezza degli animali e dei componenti il ​​monitoraggio sul supporto degli animali, la posizione del detentore degli animali al centro di una bobina RF. </li><li> Spostare la bobina RF alla sala magnete e inserire la bobina RF nel sistema di circolazione dell&#39;acqua calda posto all&#39;interno del magnete. La Figura 2 mostra alcune componenti di uno scanner MRI osservato dalla parte anteriore del magnete. </li></ol> Esperimento MRI <ol><li> Sintonizzare la bobina RF alla frequenza di risonanza 1 H e abbinare l&#39;impedenza caratteristica della bobina a 50 Ohm utilizzando il pannello messa nello scanner MR. Questo per ottenere condizioni ottimali di ricezione del segnale. Scanner MRI più umano non richiedono un processo separato in sintonia / match, trannenelle procedure di MRS. </li><li> Condurre un processo di spessoramento utilizzando una singola sequenza di impulsi. Un segnale MR si basa sulla omogeneità ambientale campo magnetico. Il processo di spessoramento consente il campo magnetico nella regione di interesse per essere il più omogenei possibile. Ogni scanner MR ha il suo modo di eseguire il processo di spessoramento, compreso automatico processi veloci spessoramento come mappa veloce e spessoramento gradiente. </li><li> Ottimizzare l&#39;impulso RF massimizzando un profilo dimensionale immagine. RF poteri di impulso può essere schierato, mantenendo costante la lunghezza degli impulsi e una lunga abbastanza TR (ritardo di riciclo) che è di circa 3 - 5 volte il T 1 di tessuto. </li><li> Acquisire esploratore immagini lungo tre orientamenti ortogonali per creare assiale, coronale e sagittale immagini. Una rapida sequenza di acquisizione delle immagini (gradient echo o alla veloce rotazione di imaging echo) può essere utilizzato per acquisire le immagini scout. Le immagini acquisite verranno utilizzati per la pianificazione per l&#39;imaging attuale con determinazione di piani d&#39;immagine. </li><li> Cambia per far girare la sequenza eco. Selezionare i parametri sequenza corretta: TR (ritardo di riciclo), dovrebbero essere tre a cinque volte il tessuto T 1 di acquisire immagini in pieno relax, come la densità protonica o T 2 pesate. TE (tempo di eco) è la durata di tempo tra il primo impulso RF e il centro del segnale eco. Un valore TE possono essere selezionate a seconda del contrasto dell&#39;immagine come riassunto nella tabella 2. La Figura 2 mostra in immagini acquisite in vivo con effetti di rilassamento differenti di T 1, T 2 e T 2 * per un mouse nudo con un tumore xenotrapianto sulla sua schiena. </li><li> T 2 misure può essere fatto sia usando multiecho immagini o immagini eco singola con più valori TE. </li><li> A seguito della MRI / MRS esperimento in vivo, gli animali devono essere monitorati durante il processo di recupero. Dopo la RM, gli animali saranno portati fuori dal bobina RF e monitorati per assicurare il pieno recupero quando tornò alla gabbia. La perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati. Tenere gli animali caldo coprendoli con garze o asciugamani e / o fornire una fonte di calore fino a quando gli animali sono recuperati da anestesia. </li></ol> Image Processing <ol><li> Rassegna delle immagini acquisite sulla console MR e il trasferimento dei dati selezionati in una post-elaborazione del computer. </li><li> Usiamo tipicamente ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) per analizzare le immagini. L&#39;analisi delle immagini comprende una scalatura delle immagini / filtro, calcoli di T 1, T 2 e la diffusione, misurazioni del volume del tumore e la segmentazione dei tumori. </li></ol> Parte 3. In Vivo MRS per muscolare degli arti posteriori del mouse scheletrici in un magnete verticale del foro Costruzione di bracciale per indurre ischemia reversibile <ol><li> Inizia con un pezzo di tubo in PVC, che è circa 5-7 millimetri di larghezza con un id di 12-15 mm. Praticare un piccolo foro attraverso la parete di questo pezzo e filo. </li><li> Tagliare un pezzo di pallone ed è quindi aperto a entrambe le estremità (palloncini elio lavoro di qualità migliore). Inserire questo pezzo attraverso il pezzo in PVC e avvolgere intorno e indietro il nastro finisce insieme sulla parete esterna del pezzo in PVC. </li><li> Usa termoretraibile per sigillare il pallone termina attorno al tubo. Si dovrebbe avere un bracciale con un muro solido esterno e una parete interna gonfiabili. </li><li> Tagliare una superficie di termoretraibile e pallone attorno al foro filettato, avendo cura di lasciare un sacco di materiale tra il foro e il bordo del pezzo in PVC. Pezzo di filo di 1,5 cm di metalli non ferrosi (ottone ad esempio) nel foro in PVC. Ciò consente di gonfiare il bracciale. Sigillare l&#39;area con 5 minuti epossidica. </li><li> Risolvere il bracciale al posto accanto alla bobina RF nella sonda MRS e connettersi a un sfigmomanometro esterno. </li></ol> Respirazione Monitor personalizzati <ol><li> Noi utilizziamo un monitor personalizzati respirazione fatto che è fatto per essere compatibile con lo spazio ristretto e l&#39;accesso al foro del magnete. Diversi modelli commerciali sono inoltre disponibili. </li><li> Legare un palloncino alla fine del tratto tubi resistenti immessa nella sonda. </li><li> Collegare l&#39;altra estremità del tubo di un trasduttore di pressione. </li><li> Assicurarsi che la linea di pallone e sono privi di bolle d&#39;aria. Le bolle si attenua il segnale dalla compressione del pallone a causa del movimento del corpo del mouse grazie alla respirazione. </li></ol> Posizionamento del mouse in MRS Probe <ol><li> Anestetizzare il mouse con il 5% Avertin (0,010 ml / g di peso corporeo). </li><li> Dopo aver raggiunto il piano chirurgico di anestesia, posizionare il mouse nella sonda MRS posizionando il mouse su le spalle al supporto per il mouse. Collocare il palloncino pieno di liquido sul lato ventrale del mouse e fissarlo in posizione con cinghie di supporto per il mouse. </li><li> Posizione del mouse e il supporto del corpo nella sonda MRS. </li><li> Tirare uno degli arti posteriori attraverso il bracciale ischemico e la bobina MRS. La gamba deve essere centrato nella bobina come much possibile. Questa disposizione permette al corpo del mouse per essere posizionato orizzontalmente in un magnete verticale foro (Figura 3). </li><li> Fissare una gamba in posizione da taping piedi supporto rigido. </li><li> Luogo termocoppia per via sottocutanea nella arti posteriori di fuori della regione campionati dalla bobina. </li><li> Inumidire gli occhi con l&#39;unguento lubrificante occhio per evitare che gli occhi si asciughi. Coprire gli occhi del mouse e volto a evitare lo sfregamento o irritazione dalla parete della sonda. </li><li> Sonde di monitoraggio di altri possono essere aggiunti a seconda delle esigenze specifiche dell&#39;esperimento. </li></ol> Impostazione Esperimento MRS <ol><li> Collegare il flusso d&#39;aria per elemento riscaldante sulla sonda MRS. </li><li> Impostare la variabile di unità di controllo della temperatura sul software VNMR per mantenere la temperatura della gamba a 35-37 ° C. </li><li> Sintonizzare la frequenza e l&#39;impedenza della bobina match usando il pannello di regolazione nel software MRS sia per 1 H e 31 risonanze P. </li><li> Regolare spessoramento circuiti per ottimizzare l&#39;omogeneità del campo magnetico B1 nella regione di interesse utilizzando 1 spettroscopia H. </li><li> Passa a 31 frequenze P per determinare la durata degli impulsi del segnale RF per produrre il massimo da un decadimento di induzione libero (FID) (90 tempo °). </li><li> Raccogliere segnale alto a spettri di rumore in pieno relax (FRS) per determinare i rapporti di fosfato inorganico (P i) e fosfocreatina (PCr) di ATP in condizioni di pieno relax. Questi spettri sono raccolti con il tempo di 90 ° con il tempo tra le acquisizioni FID (TR) di circa 5 volte il T 1 di PCr (20 sec. Alle 7 T). Questi saranno utilizzati per la quantificazione della PCR e di P i livelli di MR spettri. </li></ol> Esperimento ischemica <ol><li> Una perturbazione semplice ischemico consente la determinazione di riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale misurando i cambiamenti nella fosfocreatina durante e immediatamente dopo l&#39;ischemia. </li><li> Set-up serie di raccogliere spettri multipli usando un 45 ° larghezza di impulso (ovvero 0,5 x il 90 ° tempo) e un TR di 0,5 x T 1 (~ 1,5 sec.). Noi di solito raccogliere 4 FID per ogni spettri (numero di media (na) = 4 in VNMR software) per una risoluzione temporale di circa 6 secondi. Questa risoluzione del tempo è sufficiente per determinare con precisione il riposo e la massima produzione di ATP mitocondriale. </li><li> Raccogliere spettri di riposo per circa 5 minuti. </li><li> Indurre ischemia gonfiando il bracciale a 270-300 mmHg per 10-12 minuti. </li><li> Rilasciare il bracciale e raccogliere spettri di recupero per 5 minuti. </li><li> Rimuovere la sonda dal magnete e il mouse dalla sonda. Lasciare che il mouse per recuperare da anestesia in condizioni adeguate. Gli esperimenti possono essere ripetuti nei giorni successivi. Dopo la finale muscoli del mouse spettroscopia esperimento gambe sono immediatamente rimossi e gelo-bloccato in N 2 liquido per l&#39;analisi delle concentrazioni di ATP mediante HPLC. </li></ol> Analisi dei dati <ol><li> I dati vengono analizzati in linea con uno dei vari programmi di analisi spettrale per spettri NMR. Il nostro laboratorio utilizza in genere idonei a norma 2 e jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) per quantificare aree dei picchi. </li><li> Iniziale i tassi di guasto PCr durante l&#39;ischemia sono una misura della produzione di ATP mitocondriale in condizioni normossia come descritto in diversi documenti 3-5. PCr tassi di recupero possono essere utilizzati per determinare la capacità massima per la produzione di ATP mitocondriale sulla base di un approccio descritto in precedenza 4,6. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig1.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" /></a> Figura 1. Risonanza magnetica in vivo configurazione vista dal lato anteriore del magnete. La configurazione comprende una bobina di RF, il riscaldamento del sistema animale (o sistema di circolazione dell&#39;acqua calda) e inserire gradienti. Tutti questi componenti sono inseriti in un magnete orizzontale. L&#39;acqua calda è riscaldata in un serbatoio d&#39;acqua al di fuori della sala magnete e introdotto nel sistema di riscaldamento degli animali attraverso un tubo Tygon (nastro verde). Dopo aver circolato nel cilindro, l&#39;acqua viene estratta dal sistema di riscaldamento al serbatoio d&#39;acqua da riscaldare. Un tubo isoflurano ed il tubo a vuoto sono usate per anestetizzare topi durante gli esperimenti di risonanza magnetica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig2.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig2tmb.jpg" alt="Figura 2" /></a> Figura 2 Nelle immagini in vivo per un topo nudo con tumore xenotrapianto (D282 tumore) sulla schiena (freccia) con diversi effetti di rilassamento:. A. T 1 pesato immagine (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 pesate immagine (TR / TE = 2s/40ms). Entrambe le 2 immagini T 1 e T ponderate sono stati acquisiti dalla sequenza di spin echo. C. T mappa 2 trattati con 4 serie di immagini acquisite da DIFvalori diversi TE da 20 a 80 ms. D. T 2 * immagini pesate (TR / TE = 180/7.39ms, angolo di capovolgere = 20 gradi), acquisito dal sequenza gradiente eco. Campo visivo di 35 x 35 mm 2 è per tutte le immagini MR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig3.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig3tmb.jpg" alt="Figura 3" /></a> Figura 3. Illustrazione del mouse posizionato nel supporto corpo orizzontale con gamba fissata in bobina RF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1592/1592fig4.jpg"><img border="0" src="/files/ftp_upload/1592/1592fig4tmb.jpg" alt="Figura 4" /></a> Figura 4. In vivo 31 P spettri attraverso un ciclo di ischemia riperfusione. I dati sono stati raccolti su un magnete 7 T foro verticale e la linea ampliato con un filtro a 20 Hz esponenziale. TR = 1, na = 4, ogni spettri 20 sono tracciati. Tabella 1. Dosaggio di anestetico per mouse MRI / MRS. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Animale Specie </td><td> Anestetico Agente </td><td> Dose (Mg / kg per iniettabili) </td><td> Percorso </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Gas isoflurano </td><td> 4,0% per 2-3 min (induzione), poi 1,2-1,5% costantemente (manutenzione) </td><td> Inalato attraverso cono </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Avertin </td><td> 5%, il peso corporeo 10ml/kg </td><td> intraperitoneale (IP) </td></tr><tr><td> Mouse </td><td> Ketamina / xylazina </td><td> 100 mg / kg e 10 mg / kg </td><td> IP </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Immagine con ponderazioni relax <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Immagine di ponderazione </td><td> TR (ritardo riciclo) </td><td> TE (tempo di eco) </td></tr><tr><td> T1 </td><td> Breve (meno di T1) </td><td> Breve (meno di T2) </td></tr><tr><td> T2 </td><td> Lunga (3 ~ 5 volte T1) </td><td> Lunga (circa T2) </td></tr><tr><td> PD (densità protonica) </td><td> Lunga (3 ~ 5 volte T1) </td><td> Breve (meno di T2) </td></tr></tbody></table> T1: reticolo di rilassamento di spin (o di rilassamento longitudinale) tempo T2: rotazione di rilassamento di spin (o di rilassamento trasversale) tempo

<ol>
	<li>Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+issues+in+magnetic+resonance+imaging:+state+of+the+art.">Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art.</a> Radiol Med. 112, 491-491 (2007).</li><li>Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+spectral+analysis+of+kinetic+data+using+natural+lineshapes.">NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes.</a> Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).</li><li>Amara, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+function+in+vivo:+spectroscopy+provides+window+on+cellular+energetics.">Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics.</a> Methods. 46, 312-312 (2008).</li><li>Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separate+measures+of+ATP+utilization+and+recovery+in+human+skeletal+muscle.">Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle.</a> J Physiol. 465, 203-203 (1993).</li><li>Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+coupling+in+vivo+in+mouse+skeletal+muscle.">Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).</li><li>Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+dependence+of+muscle+phosphocreatine+kinetics+on+oxidative+capacity.">Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity.</a> Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).</li><li>Sun, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+detection+of+gliomas+by+chlorotoxin-conjugated+superparamagnetic+nanoprobes.">In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes.</a> Small. 4, 495-495 (2008).</li><li>Marcinek, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+mitochondrial+coupling+in+vivo+alters+cellular+energetics+in+aged+mouse+skeletal+muscle.">Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle.</a> J Physiol. 569, 467-467 (2005).</li></ol>

La pre-acquisizione passi di sintonia / partita e spessoramento sono fondamentali per l&#39;acquisizione ad alta risoluzione spaziale e un elevato rapporto segnale-rumore (SNR). E &#39;anche importante per monitorare le condizioni degli animali con un sistema di monitoraggio degli animali per mantenere uno stato stabile fisiologico degli animali durante acquisizioni segnale a rispettare la movimentazione animale umano e per prevenire qualsiasi misure di potenziale artefatta. Le procedure spiegato nel protocollo può ess...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inova 200 MR scanner/4.7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Bruker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for mouse MRI</td>
</tr>
<tr>
<td>Inova 300 NMR spectrometer/7 T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Varian/Oxford</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Used for MRS of mouse skeletal muscle</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

noninvasive in vivo small animal mri and mrs: basic experimental procedures

Piccoli animali risonanza magnetica (MR) la ricerca è emerso come un elemento importante della moderna ricerca biomedica a causa della sua natura non invasiva e la ricchezza di informazioni biologiche che fornisce. MR non richiede alcuna radiazioni ionizzanti e non invasivo in grado di fornire una risoluzione maggiore e migliore rapporto segnale-rumore in confronto ad altri tomografiche o modalità spettroscopica. In questo protocollo, ci concentreremo su piccoli animali RM e spettroscopia RM (MRI / MRS) per l&#39;acquisizione non invasiva relax ponderata<sup&gt; 1</sup&gt; Immagini H di mouse e di ottenere<sup&gt; 31</sup&gt; P spettri del muscolo del mouse. Questo lavoro non tenta di coprire ogni aspetto di piccoli animali MRI / MRS ma piuttosto introduce procedure di base del mouse MRI / MRS esperimenti. L&#39;obiettivo principale di questo lavoro è quello di informare i ricercatori delle procedure di base per<em&gt; In vivo</em&gt; MR esperimenti sugli animali di piccole dimensioni. L&#39;obiettivo è di fornire una migliore comprensione di base di procedure sperimentali per permettere nuovi ricercatori nel campo MR per pianificare meglio per i non-MR componenti dei loro studi in modo che sia MR e non-MR procedure sono perfettamente integrate.

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Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Questo lavoro descrive le procedure di base della risonanza magnetica non invasiva animali piccoli e MRS<em&gt; In vivo</em&gt;.

Non invasiva In Vivo Piccoli Animali MRI e MRS: Basic procedure sperimentali

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

noninvasive-vivo-small-animal-mri-mrs-basic-experimental

Research

JoVE Journal

Biology

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

16.0K Views.  University of Washington. Questo lavoro descrive le procedure di base della risonanza magnetica non invasiva animali piccoli e MRS In vivo.

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Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Ricerca

Biologia

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-wave mobilità ionica-spettrometria di massa: Basic procedure sperimentali per l&#39;analisi delle proteine ​​complesse

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

Una tecnica non invasiva di campionamento dei capelli per ottenere DNA di alta qualità da Elusive piccoli mammiferi

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are evident. A means to detect apoptosis in its earliest, reversible stages would afford a pre-clinical 'window' during which preventive or therapeutic measures could be taken to protect the heart from permanent damage. We present herein a simple and robust method to conjugate human Annexin V (ANX), which avidly binds to cells in the earliest, reversible stages of apoptosis, to superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles, which serve as an MRI-detectable contrast agent. The conjugation method begins with an oxidation of the SPIO nanoparticles, which oxidizes carboxyl groups on the polysaccharide shell of SPIO. Purified ANX protein is then added in the setting of a sodium borate solution to facilitate covalent interaction of ANX with SPIO in a reducing buffer. A final reduction step with sodium borohydride is performed to complete the reduction, and then the reaction is quenched. Unconjugated ANX is removed from the mix by microcentrifuge filtration. The size and purity of the ANX-SPIO product is verified by dynamic light scattering (DLS). This method does not require addition to, or modification of, the polysaccharide SPIO shell, as opposed to cross-linked iron oxide particle conjugation methods or biotin-labeled nanoparticles. As a result, this method represents a simple, robust approach that may be extended to conjugation of other proteins of interest.

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Early detection of apoptosis may identify at-risk cell populations in a variety of diseases. Here we demonstrate a method to link an early apoptosis-detection protein (Annexin V) to a MRI-detectable iron oxide nanoparticle (SPIO). This method may be extended to other proteins of interest to generate MRI-detectable molecular imaging probes.

Sintesi di uno<em&gt; In vivo</em&gt; RM-rilevabile Apoptosis Probe

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In Vivo Microiniezione e Elettroporazione di mouse Testicolo

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of interest. Currently, transgenic technology is becoming an indispensable tool for the study of Eimeria, the causative agents of coccidiosis in poultry and livestock. This protocol provides a detailed description of stable transfection in eimerian parasites: purification and nucleofection of sporozoites or second-generation merozoites, and in vivo propagation of transfected parasites. Using this protocol, we achieved transfection in several species of Eimeria. Taken together, nucleofection is a useful tool to facilitate genetic manipulation in eimerian parasites.

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Here, we provided a method to achieve stable transfection of chicken Eimeria parasites by nucleofecting sporozoites or second-generation merozoites. Genetically modified eimerian parasites expressing heterologous antigenic genes could be used as vaccine delivery vehicles.

Nucleofezione e Propagazione In Vivo dei Parassiti dell'Emeria del Pollo

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in all vertebrates by providing feedback to the brain and pituitary. Teleost fishes possess a higher degree of tissue plasticity and variation in reproductive&#160;strategies compared to mammals and appear to be useful models to investigate the role of sex steroids and the mechanisms by which they act. The removal of the main source of sex steroid production using gonadectomy together with blood sampling to measure steroid levels has been well-established and fairly feasible in bigger fish and is a powerful technique to investigate the role and effects of sex steroids. However, these techniques raise challenges when implemented in small size teleost models. Here, we describe the step-by-step procedures of gonadectomy in both males and female Japanese medaka followed by blood sampling. These protocols are shown to be highly feasible in medaka indicated by a high survival rate, safety for the life span and phenotype of the fish, and reproducibility in terms of sex steroid clearance. The use of these procedures combined with the other advantages of using this small teleost model will greatly improve the understanding of feedback mechanisms in the neuroendocrine control of reproduction and tissue plasticity provided by sex steroids in vertebrates.

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

The article describes a quick protocol to gonadectomize and sample blood from the small teleost fish, using Japanese medaka (Oryzias latipes) as a model, to investigate the role of sex steroids in animal physiology.

Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...