Ringraziamo i nostri collaboratori per la fornitura di campioni di proteine ​​di valore, che ha contribuito ad alcune delle nostre esperienze e le osservazioni relativi metodi. Günther Schmalzing gentilmente fornito l&#39;opportunità di FR di aderire a questo progetto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills Si ringraziano per il loro aiuto eccezionale e di ingresso delle apparecchiature. Il finanziamento è stato fornito dal NIH concedere HL090630.

1. Preparazione della griglia di prove di cristallizzazione 2D <ol><li> Carbonio rivestite 400-maglia di rame EM griglie sono preparati da macchia negativa. Acetato di uranile è usato frequentemente e offre una lunga macchia in termini di conservazione della soluzione per diversi mesi prima di utilizzarlo così come idoneità conservazione a lungo termine delle reti. Al contrario, altre macchie negative come formiato di uranile, fornendo colorazione eccellente, devono essere appena fatto 1. Per la preparazione veloce di un gran numero di griglie da utilizzare per lo screening dei processi di cristallizzazione 2D, una versione modificata di colorazione negativa viene utilizzato. Un volume di 2 ml di campione è pipettato su una griglia di carbonio coperto EM e incubate per 60 s. Questo è seguito da blotting dal bordo con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro (Figura 1; video), e poi 2 ml di acetato di uranile 1% vengono applicate immediatamente, che sono ancora una volta cancellati dal bordo della griglia dopo 30 s. Toccando la griglia sul bordo con il bordo strappato della carta da filtro garantisce la rimozione ottimale di liquido senza rimuovere proteoliposomi. Inoltre, l&#39;essiccazione al bordo della griglia assicura una migliore conservazione del film di carbonio. Si deve prestare attenzione nella preparazione e gestione delle reti, nella rottura del film di carbonio delicato previene l&#39;adesione del campione e può comportare una rappresentazione inesatta del campione. Mentre i volumi campione tradizionalmente più grandi su 5 microlitri erano e sono normalmente utilizzati per la preparazione della griglia, preziosi campioni possono essere salvati, riducendo il volume a 2 microlitri o meno 2. </li><li> Per produrre il più grande possibile membrane, alcuni dei nostri campioni richiedono alte concentrazioni di glicerolo o saccarosio (10-20%) di essere presenti nel buffer di dialisi. Questo può avere un effetto negativo sulla preparazione della griglia, come il glicerolo o saccarosio è altamente viscosi e impedisce di acetato di uranile da penetrare correttamente nel buffer, e quindi incompleto colorazione delle membrane. Di conseguenza, un reticolo possibile sarà oscurato. In entrambi i casi il buffer può essere scambiato per centrifugazione dei campioni e sostituzione con glicerolo / saccarosio senza buffer (non mostrato), o le griglie possono essere lavati con tampone o glicerolo / saccarosio senza buffer in una sola per diversi cicli prima di colorazione negativa simile a una tecnica usata per la Cryo-EM 3,4. </li></ol> 2. Valutare Prove di cristallizzazione 2D di EM <ol><li> A seconda del tipo di supporto del campione, o uno o più griglie vengono caricati. Un ingrandimento di 2-10K, che sarà denominato qui come ingrandimenti intermedi, consente una prima impressione di distribuzione media e l&#39;estensione della dispersione delle membrane, la morfologia e le dimensioni, che è preso atto nel notebook laboratorio 5. Aree idonee vengono registrati come una panoramica rappresentativa, con l&#39;aiuto di una telecamera CCD o, se una camera CCD non è disponibile, su pellicola. </li><li> Basso ingrandimento nel range di circa 400-800x è utilizzato nei momenti in cui una panoramica di tutto il campione / griglia è voluta. Pur non essendo impiegato con ogni griglia, basso ingrandimento fornisce preziose informazioni di aiuto nella valutazione della preparazione della griglia, in termini di diversi aspetti: sia le macchie negativo e il potenziale rottura parziale del film di carbonio, la concentrazione del campione sulla griglia di partenza, e forse non uniforme distribuzione proteoliposome. Quadrati della griglia individuo potrebbe essere visto con il binocolo o macchina fotografica CCD. Con un po &#39;EM è possibile salvare posizioni di particolare interesse, che possono essere richiamati per un controllo in seguito a più alto ingrandimento. </li><li> Una volta che una zona della griglia di interesse è stato identificato sia a basso ingrandimento o intermedi, l&#39;ingrandimento è cambiato a circa 50K-60K. A seconda membrana, cristallo e cellule dimensioni dell&#39;unità, se noto, ingrandimenti più bassi 30K e 80K alto come vengono utilizzati. La gamma di ingrandimento di 30-80K sarà indicato come alto ingrandimento a scopo di screening per cristalli 2D. Messa a fuoco avviene sia nella messa a fuoco delle basse dosi di set-up, con conseguente passaggio di immagine / foto impostazione, o in prossimità dell&#39;area di interesse. <ol class="lalpha"><li> In caso di ambiguità se l&#39;area di interesse è infatti una membrana, il campione è controllato per il carbonio-film nelle dimensioni dei proteoliposomi, mica, o altri artefatti. A tal fine, bordi rivelano pieghevole e morfologia tipiche. </li><li> Ora l&#39;area di interesse viene ispezionato con una telecamera CCD. Una immagine CCD viene raccolto a 30K-80K ingrandimento, a seconda delle dimensioni della membrana, di proteine ​​o di cellule dimensioni dell&#39;unità, o conosciuta zona cristallina. Il reticolo di una proteina di membrana più piccolo e / o per lo più idrofobiche non è necessariamente visibile dalla valutazione visiva delle immagini CCD stesso. Sia l&#39;intera immagine viene utilizzata per un gioco-trasformata di Fourier (FT, o fast FT-FFT). Questo FT conterrà una notevole quantità di rumore, tuttavia, se l&#39;array ordinato è piccolo. Così, un formato ridotto immagine scatola consentirà una migliore rapporto segnale-rumore di un smaller cristallo e più facile identificazione. A tal fine, la casella viene spostato sopra l&#39;immagine e un FT dal vivo è valutata. L&#39;intensità / luminosità del fascio viene regolata tenendo basse dosi di condizioni per il campione, così come le impostazioni della fotocamera CCD in mente. A seconda della camera CCD utilizzato, la gamma del FT dal vivo è regolata per l&#39;identificazione ottimale degli array ordinato. Un valore troppo alto può oscurare punti grazie ai contributi del rumore, e un valore troppo basso di gamma impedirà più deboli macchie di essere identificati. Questi punti deboli potrebbe essere dovuto alla minore array cristallino con macchie sul Financial Times appena al di sopra del livello di rumore. Mentre i dati a più alta risoluzione sono stati raccolti su un piccolo numero di campioni 6, comunemente la risoluzione dei cristalli 2D negativamente macchiato è limitata o non devono essere obbligati ad essere migliore di risoluzione di circa 15 bis. Con un defocus di circa -400 nm, non più di 1-3 ordini di spot dovrebbero essere facilmente identificabili. I campioni non sono generalmente valutati per la risoluzione, come Cryo-EM raccolta dati darà un&#39;indicazione corretta della massima risoluzione ottenibile. Nitidezza di spot e mosaicity possibili sono noti però. </li></ol></li><li> Membrane differenti, così come morfologie membrana, vengono valutati per ordine ad alto ingrandimento. Questo è particolarmente critico all&#39;inizio o fasi intermedie di processi di cristallizzazione in 2D, come proteoliposomi più piccoli e non grandi o patch di membrana può contenere le aree più promettenti. Percentuali molto basse di cristalli 2D richiederà l&#39;acquisizione di immagini e FT, o diffrazione ottica, di un gran numero di immagini in quanto l&#39;identificazione iniziale di array ordinati frequentemente portare a rapido miglioramento delle dimensioni e qualità 2,4,7. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati Proteoliposomi idealmente ordinato visualizzare facilmente riconoscibile, macchie nitide. Cristalli grandi e ben ordinata sono facilmente identificabili dal online-FT di immagini CCD o diffrazione ottica del microscopio. L&#39;esempio mostra cristalli 2D di una proteina di membrana piccolo di 18kDa che sono fino ad alcuni micron di dimensione. Macchie sul FT sono facilmente identificabili e taglienti. Il movimento del live-FT box mostra che il reticolo è continuo senza mosaicity. Il reticolo di una proteina più grande, con un dominio più esteso solubili possono essere identificati sul piccolo schermo della EM. Raccolta di immagini CCD e FT è necessario per fornire un mezzo di una migliore valutazione e per ottenere informazioni su, ad esempio, mosaicity possibile (mostra FT). Quando calcolo di una FT di un proteoliposome che non viene imposta, il rumore può essere inizialmente scambiato per spot. Mentre la casella per il live-FT è spostato, però, gli spot spariranno. D&#39;altra parte, piccoli array, con cristallinità discutibile, avranno i loro angoli ancora ferma quando il live-FT si muove anche di poco sopra la zona dell&#39;immagine. Inoltre, questi piccoli cristalli possono essere riconosciute dal solito hanno le stesse dimensioni delle celle unità, e le distanze tra i punti in FTS può essere misurato in vari modi, ad esempio con un cerchio di una dimensione specifica. Cristalli di lipidi mostra una morfologia distinta reticolo e FT. Non è raro incontrare precipitazioni nelle prove iniziali. Qui la precipitazione delle proteine ​​senza ricostituzione deve essere distinto da aggregati lipidici piccola. I campioni che sembrano essere precipitati a basso ingrandimento spesso si rivelano essere aggregati lipidici se visto a più alto ingrandimento. A fronte di ispezione a 30-50K, i bordi di queste strutture scuro rivela loro di essere composto da membrane senza precipitazione delle proteine. Queste osservazioni sono importanti quanto gli aggregati lipidici potrebbe essere aumentata per dimensioni a membrane grandi i seguenti esperimenti. Scarsi risultati in campioni di valutazione sono talvolta collegati ad una bassa concentrazione di membrana che impedisce un adeguato screening e veloce. Questo può spesso essere superato con l&#39;uso di una concentrazione di proteine ​​per la cristallizzazione 2D con la dialisi. In alternativa, le membrane può essere lasciata riposare per alcuni giorni sul fondo della provetta Eppendorf durante la conservazione. In alcuni casi un rapido assestamento, o quasi istantanea delle membrane si verifica e pipettaggio dal fondo del tubo si tradurrà in una maggiore densità di membrana sulla griglia. Un&#39;altra opzione è molto più veloce centrifugazione (a 3000-8000 giri per 1-3 minuti) di campioni con successivi prelievi dal fondo del tubo. I campioni in condizioni ottimali conterrà una grande percentuale di cristalli 2D. Non è necessario puntare per un aspetto omogeneo delle membrane, come la raccolta più grande e cristalli ben ordinata 2D sono selezionati visivamente per i dati. Questi tipi di campioni sarà facilmente riconosciuta quando le prove di cristallizzazione si ripetono così come quando i campioni sono utilizzati perCryo-EM raccolta di dati, per un numero massimo di immagini ad alta risoluzione. <img src="/files/ftp_upload/1846/1846fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. La figura mostra assorbente il bordo della griglia con un pezzo strappato di Whatman # 4 carta da filtro.

<ol>
	<li>Johansen, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+field+electron+microscopy+of+biological+specimens+V.+A+low+dose+pre-irradiation+procedure+reducing+beam+damage.">Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage.</a> Micron. 7, 145-156 (1976).</li><li>Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+crystallography+of+membrane+proteins:+Two-dimensional+crystallization+and+screening+by+electron+microscopy.">Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy.</a> Methods. 41, 417-426 (2007).</li><li>Wang, D. N., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+electron+crystallography+of+light-harvesting+chlorophyll+a/b-protein+complex+in+three+different+media.">High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media.</a> J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).</li><li>Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryomicroscopy+of+membrane+proteins:+specimen+preparation+for+two-dimensional+crystals+and+single+particles.">Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles.</a> Micron. , (2010).</li><li>Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., K&#252;hlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+human+vitamin+K-dependent+&amp;gamma;-glutamyl+carboxylase.">Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent &amp;gamma;-glutamyl carboxylase.</a> J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).</li><li>Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-helical+perturbations+of+the+flagellar+filament:+Salmonella+typhimurium+SJW117+at+9.6+&amp;Aring;+resolution.">Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 &amp;Aring; resolution.</a> J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).</li><li>Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+conditions+of+human+leukotriene+C4+synthase+requiring+a+particularly+large+combination+of+specific+parameters.">Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters.</a> J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).</li><li>Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+automated+screening+of+two-dimensional+crystals.">Towards automated screening of two-dimensional crystals.</a> J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).</li></ol>

Corretta valutazione dei campioni esige un&#39;attenta valutazione di un numero sufficiente di membrane. Per esempio, i campioni con più basso del 2% array cristallino di oltre 180 proteoliposomi ripreso ha dato delle informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione rapida delle condizioni di cristallizzazione 2D 7. Quando precipitazione delle proteine ​​si verifica, una griglia potrebbe essere abbandonata dallo screening ulteriormente dopo l&#39;ispezione a basso ingrandimento...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>400-mesh copper TEM grids coated with carbon film</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>forceps: regular and anti-capillary </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont #5 and Dumont N5AC or similar</td>
</tr>
<tr>
<td>Micropipette and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Whatman #4 filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1% uranyl acetate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dialysis sample to be screened for 2D crystals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol/sucrose-free dialysis buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>similar 80 &#x2013; 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) </td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing two-dimensional crystallization trials of small membrane proteins for structural biology studies by electron crystallography

Cristallografia elettroni si è evoluto come un metodo che può essere utilizzato in alternativa o in combinazione con tridimensionale cristallizzazione e cristallografia a raggi X per lo studio struttura-funzione domande di proteine ​​di membrana, così come proteine ​​solubili. Screening per bidimensionali (2D) i cristalli di microscopia elettronica a trasmissione (EM) è un passaggio fondamentale nella ricerca, l&#39;ottimizzazione e selezione dei campioni ad alta risoluzione di raccolta dati da Cryo-EM. Qui si descrivono le tappe fondamentali nell&#39;identificazione grandi e ordinato, così come piccoli array 2D, che possono potenzialmente fornire informazioni critiche per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di cristallizzazione. Grazie alla collaborazione con diversi ingrandimenti a EM, dati su una serie di parametri critici si ottiene. Ingrandimento inferiore fornisce dati preziosi sulle dimensioni e morfologia della membrana. A maggiore ingrandimento, dimensioni possibili cristallo ordine e 2D sono determinati. In questo contesto, è descritto come CCD e online-trasformate di Fourier sono utilizzati a più alto ingrandimento per valutare proteoliposomi per l&#39;ordine e la dimensione. Mentre cristalli 2D di proteine ​​di membrana sono più comunemente coltivate mediante ricostituzione con la dialisi, la tecnica di screening è ugualmente applicabile per i cristalli di prodotto con l&#39;aiuto di monostrati, nativo cristalli 2D, e ha ordinato gli array di proteine ​​solubili. Inoltre, i metodi qui descritti sono applicabili alla proiezione di cristalli 2D di ancora più piccoli così come proteine ​​di membrana più grande, dove proteine ​​più piccole richiedono la stessa quantità di cura per l&#39;identificazione come il nostro esempio e il reticolo di proteine ​​più grandi potrebbero essere più facilmente identificabili nelle prime fasi dello screening.

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Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l&#39;individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Georgia Institute of Technology. Valutazione bidimensionale (2D) prove di cristallizzazione per la formazione degli array ordered proteine ​​di membrana è un compito molto critico e difficile in cristallografia elettroni. Qui si descrive il nostro approccio nello screening per l'individuazione e cristalli 2D di proteine ​​di membrana prevalentemente piccole nel range di 15 - 90kDa.

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Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Ricerca

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallizzazione delle proteine ​​per la cristallografia a raggi X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Produzione efficiente e purificazione di ricombinante murino kindlina-3 da cellule di insetto per Biofisica Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron