Vorremmo ringraziare Drs. James Bowie e Salem Faham per la fornitura di competenze tecniche e linee guida sul metodo bicelle e il Dr. Aviv Paz per le discussioni utili. Riconosciamo Le Du per il supporto sperimentale. Rachna Ujwal ha interessi finanziari in MemX Biosciences LLC, che, tuttavia, non ha supportato questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalle concessioni dal NIH (RO1 GM078844).

Cristallizzazione Bicelle base è costituito da quattro fasi fondamentali (Figura 2): i) la preparazione di un lipide bicelle formazione: amphiphile miscela; ii) l&#39;incorporazione di proteine ​​purificate nel mezzo bicelle, iii) prove di cristallizzazione (manualmente o tramite macchina) e iv) visualizzazione, l&#39;estrazione di cristallo e gelo. Questi passaggi sono descritti in dettaglio di seguito 1. Preparazione del Bicelles Bicelles possono formare in una varietà di lipidi: combinazioni amphiphile e su una vasta gamma di concentrazioni. Pertanto, una composizione a base iniziale su precedenti condizioni di successo-è raccomandato (Tabella 1). La miscela di maggior successo è il DMPC: CHAPSO formulazione bicelle, che può essere acquistato sul mercato come un premiscelato pronto all&#39;uso-formulazione (vedi Tabella dei reagenti sotto) o preparati in laboratorio come descritto. Per questo esercizio ci prepareremo 1 ml di 35% DMPC: CHAPSO miscela con un rapporto 2.8:1 molare. <ol><li&gt; Pesare 0,26 g DMPC (Mr 677,9 g / mol), 0,09 g CHAPSO (Mr 630,9 g / mol) e aggiungere acqua deionizzata per un volume finale di 1,0 ml. <ul type="disc"><li> La percentuale bicelle può variare tra il 10% -40% con un DMPC: CHAPSO rapporto molare che vanno da 2.6-3.0:1 (Tabella 1). </li><li> Nota: Più alta è la concentrazione bicelle più difficile è quella di sciogliere i lipidi con conseguente maggiore viscosità soluzione. Tuttavia, una formulazione concentrata bicelle può essere vantaggioso quando la concentrazione di proteine ​​è bassa. </li></ul></li><li> Dissoluzione dei lipidi per ottenere una soluzione omogenea richiede uno sforzo considerevole, rendendo questo passo il più tempo nel metodo bicelle. Passa attraverso tutti i passaggi seguenti fino a quando il DMPC è completamente mista: <ol><li> Caldo la miscela a ~ 40 ° C con un bagno di acqua o di un incubatore e vortex per circa 1 minuto. <ul type="disc"><li> Nota: Come nel più cicli vengono effettuati, il riscaldamento il composto si tradurrà in un gel-like constiche, rendendo difficile vortice. </li></ul></li><li> Raffreddare il composto su ghiaccio e vortex per pochi minuti. Raffreddamento aiuta liquefare la soluzione rendendo più facile vortice. <ul type="disc"><li> Nota: Come nel più cicli vengono eseguiti, la miscela può diventare nuvoloso sul raffreddamento. </li></ul></li><li> Ripetere i passaggi sopra elencati (1.2.1 e 1.2.2) fino a quando la lipidico è completamente sciolto. <ul type="disc"><li> Nota: Questo processo può richiedere diverse ore. Formazione Bicelle è indicato dai cambiamenti nel comportamento fase del DMPC: formulazione CHAPSO. Al termine, la miscela sarà un gel trasparente pari o superiori a temperatura ambiente e un liquido viscoso sul ghiaccio. </li></ul></li></ol></li><li> La miscela bicelle è ora pronto all&#39;uso e può essere conservato a -20 ° C per la conservazione a lungo termine (fino a 5 anni). A causa del rischio di idrolisi del gruppo di testa dei fosfolipidi, non è consigliabile archiviare bicelles a temperatura ambiente per lunghi periodi. </li></ol> 2. Incorporazione di proteine ​​in bicelles La maggior parte delle strutture MP ottenuto dalla bicelles erano cristallizzati in DMPC: CHAPSO concentrazione bicelle vanno da 2 a 8% con una concentrazione di proteine ​​da 8 a 12 mg / ml (Tabella 1). Se possibile, schermate iniziali dovrebbero usare queste linee guida e le concentrazioni aggiuntivi possono essere proiettati in fase di ottimizzazione. Rispetto al metodo LCP, incorporazione di proteine ​​con bicelles è un processo semplice (Figura 3), che dovrebbe essere fatto lo stesso giorno le prove di cristallizzazione. <ol><li> Scongelare il DMPC: CHAPSO miscela bicelle a temperatura ambiente fino a quando i cambiamenti di fase di un gel trasparente. <ul type="disc"><li> Nota: Più di gelo-disgelo non influenzerà il comportamento bicelle. </li></ul></li><li> Mettere il composto sul ghiaccio per liquefare e brevemente vortice di ristabilire una fase omogenea bicelle. Quando posti su ghiaccio la miscela può diventare torbida. </li><li> From questo momento in poi, mantenere la miscela bicelle e proteine ​​purificate su ghiaccio. Ciò manterrà il bicelle in una fase liquida che lo rende suscettibile di pipettaggio. </li><li> Aggiungere il composto alla bicelle purificato detergente-solubilizzate proteine ​​in un (V / V) rapporto 1:4. <ul type="disc"><li> Ad esempio: 100 l di proteine ​​bicelle miscela si ottiene mescolando 80 microlitri di proteine ​​con 20 microlitri bicelle. Se la concentrazione di proteine ​​è di 15 mg / ml e la concentrazione bicelle è del 35%, questo darà un bicelle-incorporato miscela proteica con una concentrazione proteica di 12 mg / ml e una concentrazione bicelle del 7%. </li></ul></li><li> Mescolare pipettando gentilmente il contenuto su e giù fino a quando la soluzione diventa chiara e omogenea. <ul type="disc"><li> Nota: Se compaiono delle bollicine, un giro veloce (30-60 secondi, 13000 rpm, 4 ° C) con una centrifuga da tavolo può aiutare a rimuoverle. </li></ul></li><li> Incubare la miscela in ghiaccio per almeno 30 minuti per promuovere incorporazione di proteina into bicelles. La proteina-bicelle impasto è ora pronto per le prove di cristallizzazione. </li></ol> 3. La creazione di processi di cristallizzazione Altre tecniche di cristallizzazione dei lipidi come il LCP richiede attrezzature specializzate a causa di elevata viscosità del medium, ma il comportamento di fase unica di bicelles permette di implementazione in qualsiasi formato standard, tra cui la cristallizzazione robotica (Figura 3). Processi di cristallizzazione può essere effettuato in uno impiccagione o seduti formati goccia utilizzando le normali schermi disponibili in commercio. <ol><li> Se la creazione di vassoi manualmente o utilizzando un robot cristallizzazione, mantenere la proteina-bicelle miscela sul ghiaccio. Ciò manterrà la proteina-bicelle freddo miscela e garantire che la viscosità della soluzione è minimo. </li><li> Prove cristallizzazione manuale - Con un contagocce standard, la proteina-bicelle miscela può essere miscelato con una soluzione serbatoio nello stesso modo come normalmente eseguirea cura di proteine ​​di membrana solubile o detergente-solubilizzato. <ul type="disc"><li> Nota: Conservare la proteina-bicelle miscela in ghiaccio durante le prove. </li></ul></li><li> Prove cristallizzazione robotica - Abbiamo adattato questi studi per il robot cristallizzazione Mosquito, ma in linea di principio (seguendo le stesse precauzioni), la tecnica dovrebbe essere compatibile con tutti i robot cristallizzazione. I seguenti suggerimenti in modo che la proteina-bicelle miscela rimane fresco e con precisione pipettati dal robot: <ol><li> Preraffreddare la piastra ad accumulo di proteine ​​bicelle miscela ponendolo sul ghiaccio. </li><li> Pipetta la proteina-bicelle composto nella piastra e continuare a tenere la piastra su ghiaccio. Questo piatto deve essere l&#39;ultimo elemento ad andare sul robot prima di iniziare la corsa. </li><li> Set-up del vassoio serbatoio e coperchi cristallizzazione su piattaforma 3 e 5, rispettivamente, del robot zanzara. </li><li> Posizionare la piastra contenente proteine ​​bicelle composto su piattaforma 4del robot zanzara. Questo assicura la proteina-bicelle miscela è l&#39;ultimo ad essere preso dal robot ed è immediatamente rilasciato. </li><li> Per evitare che il riscaldamento e la viscosità aumentata, non mescolare il serbatoio con la proteina-bicelle miscela. </li><li> Durante l&#39;esecuzione di schermi multipli, restituire immediatamente la bicelle-proteina piastra di ghiaccio per il raffreddamento non appena una corsa è stata completata. </li></ol></li><li> Volume delle gocce e il rapporto (proteine: serbatoio) può essere scelta come per le prove di cristallizzazione convenzionali. Per esempio, prove di cristallo iniziale utilizzando il robot Mosquito può essere impostato utilizzando 0,25 microlitri di proteine: miscela bicelle serbatoio maggiorato dello 0,25 microlitri. </li><li> Incubare le prove di cristallo in una camera a 20 ° C. La temperatura è uno screening buono e l&#39;ottimizzazione dei parametri perché il comportamento fase di bicelles dipende dalla temperatura. <ul type="disc"><li> Temperature più elevate indurre la fase lamellare 12 (Figura 1), che ha il vantaggio di pre-organizzazionela proteina in strati. Temperature sotto i 20 ° C possono essere sottoposti a screening, ma non si dovrebbe andare sotto i 4 ° C dal momento che questo può causare i lipidi di precipitare per lunghi periodi di tempo. </li></ul></li><li> Allo stesso modo, come prove di cristallizzazione tradizionali, prove bicelle devono essere monitorati regolarmente per l&#39;aspetto cristallino e la crescita. Si consiglia di verificare vassoi il 1 ° e 3 ° giorno post-installazione seguita da ispezione settimanale. </li><li> Ottimizzazione di cristallo può essere effettuata con metodi abitualmente utilizzati per i cristalli di detergenti a base di griglia incluso screening, lo screening additivo, cambiando ecc temperature Inoltre, la percentuale bicelle e proteine: il rapporto bicelle può essere variata. Inoltre, bicelles può essere drogato con lipidi specifici che possono essere necessarie per la stabilità proteica o funzione. </li></ol> 4. Visualizzazione, estrazione di cristallo e il congelamento In quanto le prove di cristallo con la proteina-bicelle miscela<html> hanno una viscosità simile a quella proteina-detergente gocce, la visualizzazione e l&#39;estrazione di cristallo è di routine e viene effettuato come i tradizionali set-up. <ol><li> Visualizzazione: A differenza dei media LCP che richiede spesso di alta qualità di illuminazione a luce normale e polarizzata per il rilevamento di cristallo, la visualizzazione non è ostacolato da bicelles. Colorati così come gocce di cristallo incolore proteine ​​possono essere facilmente analizzati utilizzando microscopi standard e nessuna attrezzatura speciale è richiesta. </li><li> Bicelles, come gli altri mezzi di comunicazione lipidico, tendono a produrre un&#39;alta percentuale di falsi positivi. Un microscopio UV aiuta molto nel differenziare le proteine ​​da cristalli di sale (Figura 4). </li><li> Estrazione e di congelamento: estrazione di cristallo e il congelamento è relativamente semplice e non richiede dissoluzione dei media bicelle circostante. Inoltre, la fase bicelle stesso fornisce alcune moderato crio-protezione. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <html> nt &quot;&gt; Di solito, occorrono 2-3 giorni per i cristalli di apparire e di circa una settimana o più per loro di crescere fino alla loro dimensione massima. È il caso per batteriorodopsina e mouse voltaggio-dipendenti canale anionico 1 (mVDAC1) i cristalli 4,8 . Per altre proteine ​​di membrana che può richiedere diverse settimane per la crescita dei cristalli, per cui è importante continuare a monitorare i processi di cristallo ben oltre le prime settimane. Come con altri mezzi di comunicazione lipidica, bicelles tendono a formare forme che possono sembrare cristallina. E &#39;stato inoltre osservato che conducono ad una maggiore percentuale di cristalli di sale e detergente. A UV-microscopio a fluorescenza che rileva triptofano può significativamente contribuire ad eliminare questi falsi positivi non proteinico. La figura 4 mostra forme di lipidi, sali e cristalli di proteine ​​come si vede nella luce visibile e UV per aiutare a distinguere i diversi risultati che possono essere osservati. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Bicelle schematica. Bicelles sono composti da una molecola di formare doppio strato lipidico, come DMPC (blu) e un amphiphile come CHAPSO (verde), che protegge i bordi idrofobica del doppio strato. Quando la temperatura è aumentata, disco-come bicelles subire una trasformazione di fase in un 12 lamiera lamellare. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Figura 2. Diagramma di flusso per il metodo di cristallizzazione bicelle che delinea le quattro fasi fondamentali. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Figura 3. Cristallo prove di set-up schematica. Purificato detergente-solubilizzato proteine ​​di membrana può essere miscelato direttamente con bicelles su ghiaccio semplicemente pipettamento i contenuti insieme. Dopo l&#39;incubazione della proteina / bicelle miscela in ghiaccio per circa 30 minuti, prove di cristallizzazionepuò essere configurato con tutti i formati standard, tra cui la robotica. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Figura 4. Visualizzazione di prove cristallo. Immagine visibile (pannello superiore) e l&#39;immagine ai raggi UV (pannello inferiore) di (A) Ago a forma di cristalli di sale, osservata in un solo stato. Fluorescenza non possono essere rilevati dai cristalli, l&#39;indicazione di falsi positivi. (B) Rod a forma di cristallo formato in una condizione di MPD. Il cristallo fluorescente debolmente, ma è risultato essere non-proteici con diffrazione di raggi X. (C) Cristallo osservato circa quattro settimane dopo la creazione di prove. La forte fluorescenza ai raggi UV conferma si tratta di un cristallo di proteina. <table border="1"><tbody><tr><td> No. </td><td> Proteina </td><td> Fonte </td><td> Bicelle Formulazione </td><td> Concentrati di proteinesu </td><td> Detergente 1 </td><td> Risoluzione (Å) </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Batteriorodopsina 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> 8% DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2,0 </td><td> Faham e Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 8% DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1,8 </td><td> Faham et al., 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-recettori adrenergici / complesso Fab </td><td> Homo sapiens </td><td> 8,3% DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen et al., 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltaggio-dipendenti canale anionico 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> 7% DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2,3 </td><td> Ujwal et al., 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> 4,2% DMPC, 5% NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1,9 </td><td> Luecke et al., 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Romboidale della proteasi </td><td> Escherichia coli </td><td> 2% DMPC: CHAPSO (2.6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Glucoside nonil </td><td> 1,7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> 1 detergente usato per la purificazione delle proteine ​​di membrana 2 lipidi native da membrane viola può essere effettuato lungo durante la purificazione Tabella 1. Sintesi delle condizioni di cristallizzazione per le strutture di proteina di membrana risolto utilizzando bicelles.

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	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Bicelles sono un media unico lipidico che offrono un nativo doppio strato, come l&#39;ambiente mentre si comportano come se solubilizzato da detergenti. Questa proprietà dà bicelles un netto vantaggio rispetto ad altre a base di lipidi metodi di cristallizzazione in quanto non vi è alcuna curva di apprendimento o di attrezzature specialistiche richieste per questa tecnica. Una volta bicelles sono disponibili, siano esse commerciali o preparati in laboratorio, possono essere miscelato direttamente con proteine ​​p...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Proteine ​​di membrana (MP) giocano un ruolo critico in molti processi fisiologici come il pompaggio di molecole specifiche attraverso il doppio strato di membrana impermeabile in caso contrario che circonda tutte le cellule e gli organelli. Alterazioni nella funzione del risultato parlamentari in molte malattie ei disturbi umani, quindi, una conoscenza intricata delle loro strutture rimane un obiettivo critico per la ricerca biologica. Tuttavia, la determinazione della struttura dei deputati rimane una sfida significativa spesso derivanti dalla loro idrofobicità. Parlamentari hanno notevoli regioni idrofobiche incorporato all&#39;interno del doppio strato. I detergenti sono spesso usati per solubilizzare queste proteine ​​dal doppio strato generando una proteina-detergente micellare che possono poi essere manipolati in modo simile come proteine ​​solubili. Tradizionalmente, i processi di cristallizzazione procedere con una proteina-detergente miscela, ma spesso resistono cristallizzazione o produrre cristalli di scarsa qualità. Questi problemi sorgono a causa dellaincapacità del detersivo per simulare adeguatamente il doppio strato con conseguente scarsa stabilità ed eterogeneità. Inoltre, gli scudi detergente sulla superficie idrofobica del MP riducendo la superficie disponibile per i contatti cristallo. Per aggirare questi inconvenienti i parlamentari possono essere cristallizzate nei media lipidico, che più da vicino simula l&#39;ambiente endogeno, ed è recentemente diventata una tecnica de novo per la cristallizzazione MP. Lipidico fase cubi (LCP) è un tridimensionale doppio strato lipidico penetrata da un sistema interconnesso di canali acquosi 1. Anche se monoolein è la scelta di lipidi, lipidi correlati come monopalmitolein e monovaccenin sono stati utilizzati anche per fare LCP 2. Parlamentari sono incorporati nella LCP dove si diffondono in tre dimensioni e cristallo nuclei feed. Un grande vantaggio del LCP è che la proteina rimane in un ambiente più nativo, ma il metodo ha una serie di inconvenienti tecnici compresi visc altaosity (che richiedono apparati specializzati) e le difficoltà nella visualizzazione di cristallo e la manipolazione 3,4. A causa di queste difficoltà tecniche, abbiamo utilizzato un altro mezzo lipidico per la cristallizzazione-bicelles 5,6 (Figura 1). Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile costituito dal taglio di un lipide fosfatidilcolina (DMPC) con un amphiphile (CHAPSO) o una catena corta lipidi (DHPC). All&#39;interno di ogni disco bicelle, le molecole generano un doppio strato lipidico mentre la linea amphiphile molecole apolari che fornisce i bordi proprietà benefiche di entrambi doppi strati e detergenti. È importante sottolineare che, sotto la loro temperatura di transizione, proteine ​​bicelle miscele hanno una viscosità ridotta e sono manipolati in modo simile come detergente-solubilizzato parlamentari, rendendo bicelles compatibile con i robot cristallizzazione. Bicelles sono stati utilizzati con successo per cristallizzare proteine ​​di membrana diverse 5,7-11 (Tabella 1). Questa raccolta in crescitadelle proteine ​​dimostra la versatilità di bicelles per cristallizzare sia elicoidale alfa e beta parlamentari foglio da fonti procariote ed eucariote. A causa di questi successi e la semplicità di high-throughput attuazione, bicelles dovrebbero far parte dell&#39;arsenale di ogni cristallografo proteina di membrana è. In questo video, si descrive la metodologia bicelle e fornire uno step-by-step del protocollo per la configurazione high-throughput prove di cristallizzazione purificata parlamentari utilizzando la robotica standard.

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine ​​di membrana (MP) all&#39;interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorporando i deputati nella miscela bicelle, la creazione di prove cristallizzazioni (manualmente così come robot) e cristalli raccolta dal mezzo.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.5K Views.  University of California Los Angeles. Bicelles sono miscele di lipidi / amphiphile che mantengono proteine ​​di membrana (MP) all'interno di un doppio strato lipidico, ma hanno un comportamento unico che facilita la fase di high-throughput screening da robot cristallizzazione. Questa tecnica ha prodotto con successo un certo numero di strutture ad alta risoluzione da entrambe le fonti procariote ed eucariote. Questo video descrive i protocolli per la generazione della miscela lipidica bicelle, incorpo...

Video: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Ricerca

Biologia

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Cristallizzazione high-throughput di proteine di membrana con il metodo lipidica Bicelle