L&#39;autore ringrazia il Dott. Matthias Mann per il continuo supporto e la signora Katharina Zettl per dimostrare il metodo. Questo lavoro è stato supportato dal Max-Planck per l&#39;Avanzamento della Scienza.

1. Strumentazione necessaria <ol><li> Preparazione di fette di tessuto per microdissezione e il campione lisi <ol><li> Thermoblock impostato a 99 ° C o di una vasca da bagno con acqua bollente. </li><li> Laser microdissector operativo (ad esempio PALM, Zeiss, Göttingen, Germania). </li><li> Termostatato da banco centrifuga, la temperatura impostata a 20 ° C. </li><li> Camera umida (box) con un rack per tubi di smaltimento Eppendorf tipo. </li><li> Incubatore a 37 ° C. </li><li> Spettrofluorimetro consentendo di misurazione della fluorescenza eccitata vicino a luce UV con cuvette di quarzo micro-scala (0,1-0,2 ml). </li></ol></li></ol> 2. Soluzioni <ol><li> &#39;Tissue Lysis Buffer&#39; (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0.5% (w / v) di polietilenglicole 20.000 e 4% SDS. </li><li> Soluzione UA: 8 M urea in 0,1 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 1 ml per 1 campione. Le soluzioni UA e IAA devono essere preparate al momento e utilizzati entro un giorno. </li><li> Soluzione IAA: 0,05 M iodoacetamide in UA. Preparare 0.1 ml per 1 campione. </li><li> Endoproteinase Lys-C, soluzione stock. </li><li> Tripsina, soluzione stock. </li><li> &#39;Digestione del buffer&#39; (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 0,25 ml per 1 campione. </li><li> &#39;Triptofano Soluzione Standard&#39;: 0,1 mg di triptofano in 1 ml di acqua deionizzata. </li><li> &#39;Assay buffer di B&#39; (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. </li><li> Soluzione madre di Britton &amp; Robinson Tampone universale (BRUB). Preparare una soluzione contenente 0,1 M CH 3 COOH, 0,1 MH 3 PO 4, e 0,1 MH 3 BO 3 e regolare con 1 M NaOH al pH desiderato (2, 4, 5, 6, e 11). Prima dell&#39;uso diluire 5 volte con acqua deionizzata. </li><li> Tampone A: 1% (v / v) CH 3 COOH in acqua deionizzata. </li><li> Tampone B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in acqua deionizzata. </li></ol> 3. Pipetta Tip e colonne &quot;StageTip &#39; <ol><li> Preparare SAX tip-colonna impilando 6 strati di membrana Empore-anioni in un common 0,2 ml punta della pipetta. Fare due colonne SAX-tip per campione. </li><li> Preparare &#39;StageTip&#39; impilando 3 strati di Empore-C 18 in un puntale di 0,2 ml. Effettuare 6 punte palco per ogni campione. </li></ol> 4. Preparazione di fette di tessuto per Microdissection e dei Campioni Lysis <ol><li> Tagliare sezioni con un microtomo (lo spessore delle fette dipende dal campione. Solitamente microdissezione funziona bene con le fette di 7-10 micron). </li><li> Irradiare diapositive membrana (MembraneSlide 1.0 PEN) con raggi UV per 45 min. </li><li> Montare le sezioni sui vetrini di membrana irradiare e asciutto, a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Sparaffinare e portare le sezioni montati da due incubazioni successive in xilene per 2,5 minuti e 1,5 min. Reidratare le sezioni da incubazioni consecutivi in ​​etanolo assoluto, etanolo al 70% e acqua, ciascuno per 1 min. </li><li> Macchiare le sezioni con ematossilina di Mayer per 20 secondi, sciacquare con acqua per 1 minuto, e aria secca. </li><li> Raccogliere le populati cellularisu interessi utilizzando il sistema di microdissezione laser capture. Quando si utilizza lo strumento PALM (Zeiss) raccogliere i campioni nei tappi adesivi (adesivi PAC 200). </li><li> Pipettare un&#39;aliquota del TLB sul materiale microdissezione nel tappo. Chiudere la provetta e raccogliere la sospensione con un breve centrifugazione. Lyse tessuto microdissezione a 99 ° C su una piastra riscaldante con agitazione (600 rpm) per 1 ora. Utilizzare 3 ml di tampone per 10 nl del tessuto microdissezione. </li><li> Chiarire l&#39;estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 xg a 18 ° C per 10 min. Il lisato può essere conservati congelati a -20 ° C. </li></ol> 5. Elaborazione del campione <ol><li> Mescolare fino a 50 ml di lisato chiarificato con 200 ml di UA nelle unità di ultrafiltrazione (30k forense) e centrifugare a 14000 g fino a meno di 10 microlitri della soluzione rimarranno nel filtro. Di solito questo passo richiede 10-15 minuti centrifugazione. </li><li> Pipettare 200 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazionee centrifugare come in 5.1. Svuotare il tubo di raccolta. </li><li> Pipettare 50 ml di soluzione di IAA e miscelare a 600 rpm in una termo-mixer per 1 min e centrifugare come in 5.1. </li><li> Aggiungere 100 ml di UA all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare come in 5.1. Ripetere questa operazione due volte </li><li> Dispensare 100 ml di DB all&#39;unità di ultrafiltrazione e centrifugare a 5.1. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Trasferire le unità di filtrazione a nuovi tubi di raccolta. Pipettare 40 microlitri DB con endoproteinase Lys-C (proteinasi rapporto proteine ​​totali di 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Centrifugare le unità filtranti a 14000 g come in 5.1. </li><li> Pipettare 160 ml di acqua deionizzata e centrifugare le unità filtranti come in 5.1. La flow-through pool (5.7 e 5.8 punti) contiene i peptidi rilasciati da endoproteinase Lys C. </li><li> Trasferire unità di ultrafiltrazione a un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 40 microlitriDB con tripsina (enzima proteina rapporto 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 4 ore. Ripetere i punti 5.7 e 5.8 per raccogliere i peptidi triptici. </li></ol> 6. La quantificazione dei peptidi <ol><li> La misurazione del contenuto di peptide in digest proteina può essere eseguita in tampone diluito perché i residui di triptofano sono ben accessibile al solvente. </li><li> Pipettare 0,2 ml di ABB in cuvetta di quarzo e registrare lo spettro di emissione di &#39;vuoto&#39;. </li><li> Preparare curva di calibrazione utilizzando 0,1 mg passi con l&#39;aggiunta di 1 ml aliquote TSS alla cuvetta e delicato mix con la ABB. </li><li> Pulire la cuvetta. </li><li> Pipettare il campione e registrare lo spettro (campione). </li><li> Calcolo della concentrazione di proteine ​​e peptidi Da 0.1 mg triptofano corrisponde a circa 9 mg proteina (basata sulla media 1.1% del contenuto di triptofano in miscele proteiche ottenute by lisi cellule umane), il contenuto proteico della a contenuto campione o peptide nel digest è pari a: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2.787in" fo:src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50589/50589eq1.jpg" /> dove F (Standard1) è la fluorescenza di 0.1 mg standard di triptofano. Il contenuto peptide permette di calcolare la resa del procedimento digestione e fornisce informazioni essenziali per seguenti peptide frazionamento e spettrometria di massa. </li></ol> 7. Il frazionamento delle Lys-C e trittico peptidi <ol><li> Diluire le soluzioni di peptidi ottenuti dalla digestione con Lys-C e tripsina con 0,2 ml di BRUB pH 11 e pH 5, rispettivamente. </li><li> Montare la punta della colonna SAX nella centrifuga coperchio dell&#39;adattatore tubo. </li><li> Lavare ed equilibrare la punta-colonna SAX successivamente con 0,1 ml di metanolo, 0,1 ml di 1 M NaOH, e 3 volte con 0,1 ml di BRUB, pH 11 per la separazione di Lys-C Peptides e con BRUB, pH 5 per i peptidi triptici. Il flusso delle soluzioni mediante il materiale della colonna è facilitato mediante centrifugazione a 4000 x g. </li><li> Lavare ed equilibrare le C 18 - &#39;StageTips&#39; successivamente, con 0,05 ml di metanolo, poi con 0,05 ml di tampone B e con 0,05 ml di tampone A. Preparare sei C 18 - &#39;StageTips; 4 per la separazione del Lys- peptidi C e due per la separazione dei peptidi triptici. </li><li> Montare il SAX Tip-colonna della C 18 - &#39;StageTip&#39;. Caricare le soluzioni campione nelle SAX Tip colonne equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 xg per 3 min. </li><li> Equilibrare le colonne &quot;pipetta a punta&quot; con 0,1 ml di BRUB, pH 11 o pH 5, rispettivamente al Lyc-C e campioni triptici. Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 x g. </li><li> Trasferire la Tip-colonna SAX alla prossima C 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Continua eluizione dei peptidi con BRUB pH 6, 4 e 2 per il campione Lys C e con BRUB pH 2 per il campione con peptidi triptici. Per ogni fase di eluizione usare un C separato 18 - &#39;StageTip&#39;. </li><li> Lavare le C 18 - &#39;StageTips&#39; con 0,05 ml di tampone A. </li><li> Eluire frazioni con 0,05 ml di tampone B in fiale utilizzate direttamente per l&#39;iniezione dei campioni nel sistema LC assemblati con uno spettrometro di massa. </li></ol>

<ol>
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R., Dus, K., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+workflow+for+analysis+of+archival+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+clinical+samples+to+a+depth+of+10+000+proteins.+Proteomics.">Proteomic workflow for analysis of archival formalin-fixed and paraffin-embedded clinical samples to a depth of 10 000 proteins. Proteomics.</a> Clin. Appl. 7 (3-4), 225-233 (2013).</li><li>Magdeldin, S., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+deciphering+proteomes+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+(FFPE)+tissues.">Toward deciphering proteomes of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues.</a> Proteomics. 12 (7), 1045-1058 (2012).</li><li>Ostasiewicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome,+phosphoproteome,+and+N-glycoproteome+are+quantitatively+preserved+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+and+analyzable+by+high-resolution+mass+spectrometry.">Proteome, phosphoproteome, and N-glycoproteome are quantitatively preserved in formalin-fixed paraffin-embedded tissue and analyzable by high-resolution mass spectrometry.</a> J. Proteome Res. 9 (7), 3688-36700 (2010).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature. 6 (5), 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Ostasiewicz, P., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+recovery+FASP+applied+to+the+proteomic+analysis+of+microdissected+formalin+fixed+paraffin+embedded+cancer+tissues+retrieves+known+colon+cancer+markers.">High recovery FASP applied to the proteomic analysis of microdissected formalin fixed paraffin embedded cancer tissues retrieves known colon cancer markers.</a> Journal of proteome research. 10 (7), 3040-3049 (2011).</li><li>Wisniewski, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+quantitative+remodeling+of+the+proteome+between+normal+colon+tissue+and+adenocarcinoma.">Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.</a> Mol. Syst. Biol. 8, 611 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consecutive+proteolytic+digestion+in+an+enzyme+reactor+increases+depth+of+proteomic+and+phosphoproteomic+analysis.">Consecutive proteolytic digestion in an enzyme reactor increases depth of proteomic and phosphoproteomic analysis.</a> Anal. Chem. 84 (6), 2631-2637 (2012).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+FASP+and+StageTip-based+fractionation+allows+in-depth+analysis+of+the+hippocampal+membrane+proteome.">Combination of FASP and StageTip-based fractionation allows in-depth analysis of the hippocampal membrane proteome.</a> J. Proteome Res. 8 (12), 5674-5678 (2009).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75 (3), 663-670 (2003).</li><li>Thompson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+pre-analytical+factors+on+the+proteomic+analysis+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue.">Impact of pre-analytical factors on the proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Proteomics Clin. Appl. , (2012).</li></ol>

L&#39;autore non ha nulla da rivelare.

La possibilità di studiare il materiale FFPE dalla tecnologia proteomica ad una profondità comparabile con il sequenziamento degli acidi nucleici e delle tecniche di microarray apre nuove prospettive nella biomarker e la destinazione della droga scoperta. Il protocollo descritto ha la caratterizzazione e quantificazione di proteoma di popolazioni di cellule microdissezione su una scala da 10.000 proteine. Quando si utilizza meno del materiale microdissezione un set di dati più piccoli possono essere generati, ma forse in molti casi quelli può anche fornire dati clinici importanti. Così, sia i campioni possono essere analizzati direttamente dopo la procedura MED-FASP o possono essere separati in meno frazioni. Poiché procedura FASP è compatibile con qualsiasi tipo di proteasi, altri enzimi o la loro combinazione può essere utilizzato dalla digestione delle proteine ​​6. La qualità del materiale FFPE sembra essere il problema più critico dell&#39;analisi. Abbiamo sperimentato che il tessuto fissato della stessa origine ma provenienti da differisconocliniche ORL avevano proprietà distinte. Utilizzando il tessuto da una fonte siamo stati in grado di generare peptidi ad alti rendimenti, mentre materiale simile da un&#39;altra clinica era quasi inutile. E &#39;probabile che la fissazione applicata e procedure incorporamento nonché condizioni di conservazione sono i principali fattori che influenzano le proprietà del materiale clinico 12. Pertanto è consigliabile testare le proprietà di alcuni campioni prima di iniziare un progetto più ampio. Molte pubblicazioni hanno riportato l&#39;uso del materiale FFPE in passato. Tuttavia, il numero di proteine ​​identificate in questi studi non superare più di 1.000-2.000 proteine ​​4. Considerando le dimensioni delle proteoma specifici di cellule umane aventi più di 10.000 proteine, tali studi sono stati in grado solo di fornire un quadro molto superficiale, quasi limitato a proteine ​​altamente abbondanti coinvolte in funzioni di manutenzione. Il nostro protocollo permette l&#39;isolamento efficiente del clinico o biologico materiale from conservato tessuto ed è ottimizzata per lisi, trasformazione di proteine ​​e peptidi prefrazionamento. Di conseguenza il nostro flusso di lavoro di preparazione del campione, quando accoppiato al spettrometria di massa di fascia alta, permette intuizioni di un proteoma quasi completi. Notevole, questo è possibile a requisiti di quantità di campione minuti. Il principale vantaggio di utilizzare i tessuti conservati è la loro relativa ampia disponibilità. Campioni FFPE archiviati per molti anni e decenni, e talvolta considerati come inutile, ora, grazie alla tecnologia proteomica, appaiono come materiale di grande valore per la ricerca clinica. Considerando che molte malattie possono essere studiate usando fresche o congelate indagine materiale di materiale FFPE sembra essere particolarmente importante per lo studio delle malattie rare 12, erano raccolta di una serie rappresentativa di campioni di solito richiede molto tempo.

Fissaggio con paraformaldeide e l&#39;inclusione in paraffina (FFPE) è il metodo standard per la conservazione e ricerca pathomorphologic di materiale tessuto clinico. Microscopia del tessuto conservato permette l&#39;identificazione di malattie legate cambiamenti morfologici, e la rilevazione e il punteggio di insorgenza di malattie legate antigeni. Dal momento che in genere solo una piccola parte del campione FFPE viene utilizzato in queste analisi, grandi quantità di materiale clinico rimangano archiviati e possono essere sfruttati in altri tipi di studi. Durante la recente decennio della ricerca nelle scienze della vita è stata rafforzata dalla potente tecnologia proteomica. Questa tecnologia consente l&#39;identificazione e la quantificazione di migliaia di proteine ​​in miscele complesse di proteine. Una caratteristica importante della tecnologia è che solo piccole quantità di materiale sono necessari per analisi su vasta scala. Recenti studi di proteomica hanno dimostrato che le proteine ​​possono essere studiate su una scala di quasi compLete proteoma 1, 2. Questo tipo di sistema permette indagini ampie conoscenze nella composizione delle cellule e l&#39;identificazione dei gruppi di proteine ​​che si verificano a livelli anomali nelle malattie. Considerando che tali studi richieste grandi capacità di spettrometria di massa, il recente lavoro ha dimostrato che simili entità della identificazione può essere raggiunto entro un solo giorno di misura 3. Il requisito di importo relativamente basso del campione e l&#39;ampia disponibilità di campioni clinici conservati noi e gli altri tentati di sviluppare metodi che permettano l&#39;esplorazione proteomica del materiale FFPE (per una rassegna vedi 4). Sfruttando la reversibilità della fissazione in formalina in un trattamento termico abbiamo sviluppato un protocollo che permette l&#39;estrazione quantitativa delle proteine ​​dal tessuto fissa 5. Abbiamo dimostrato che la procedura di sintesi conserva non solo proteine, ma anche almeno alcune modifiche post-traduzionali. Fosforylation e N-glicosilazione possono essere studiate usando i campioni FFPE 5, tuttavia un prerequisito perché è una delle condizioni di incasso dei tessuti, di stoccaggio e di fissazione controllati accuratamente. Successivamente, abbiamo ottimizzato il metodo di cattura microdissezione laser del tessuto fissato e per la proteomica reattore basato campione di trasformazione 6, 7. Uno studio su larga scala su cancro colorettale ha permesso l&#39;analisi quantitativa di 7.500 proteine ​​da microdissezione da materiale clinico 8. Infine, abbiamo migliorato il modo di esplorazione del materiale microdissezione mediante l&#39;applicazione consecutiva-two protocollo digestione delle proteine ​​passaggio 9. Rispetto alle strategie di digestione comuni utilizzando singolo enzima, questa procedura permette la generazione di più peptidi di sequenza univoco e, di conseguenza, si traduce in una maggiore profondità di identificazione delle proteine. Analisi di microdissezione adenoma del colon umano ha permesso l&#39;analisi proteomica ad una profondità di 9.500 proteine ​​per campione 3. In questo stalloney abbiamo mappato 55.000 peptidi per campione permettono l&#39;identificazione di 88-89% di proteine ​​con almeno 2 peptidi. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per la preparazione di campioni dal materiale FFPE per l&#39;analisi LC-MS/MS. Questo protocollo comprende preparazione di fettine di tessuto per microdissezione, lisi delle cellule isolate, e trattamento del campione in un formato reattore (FASP) 6. Poi si descrive una determinazione spettrofluorimetrico delle rese peptide, un compito con grande importanza per l&#39;identificazione ottimale peptide dalla spettrometria di massa. Infine, abbiamo dimostrato una forte scambiatore anionico (SAX) a base di tecnica di separazione per il peptide frazionamento. In questo metodo sia la separazione peptide e la pulizia finale sono effettuate utilizzando microcolonne pipetta-ribaltamento 10, 11. Questo passaggio è facoltativo ma è raccomandato in studi in cui più di pochi microgrammi di peptidi possono essere ottenuti da un singolo campione. Il SAX-frazionamento in grado di aumentare notevolmente il numero e la gamma dinamica di identPrecisazioni ed estendere la copertura sequenza proteica 3, 10.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>MembraneSlide 1.0 PEN</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9041-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Adhesive Cap 200 opaque</td>
			<td>Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany</td>
			<td>415190-9181-000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mayer's hematoxylin solution </td>
			<td>Sigma-Aldrich St. Louis, MO</td>
			<td>MHS32</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forensic 30k </td>
			<td>Merck Millipore Darmstadt, Germany</td>
			<td>MRCF0R030 </td>
			<td>(Previously sold as Microcon YM-30) </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore Anion</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN </td>
			<td>2252</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Empore C18</td>
			<td>Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN</td>
			<td>2215</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypsin </td>
			<td>Promega </td>
			<td>2014-06-27</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Wako</td>
			<td>129-02541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

proteomic sample preparation from formalin fixed and paraffin embedded tissue

Materiale clinico conservato è una fonte unica per l&#39;indagine proteomica delle patologie umane. Qui si descrive un protocollo ottimizzato che consente larga scala l&#39;analisi quantitativa dei fissato in formalina e incluso in paraffina (FFPE) tessuti. La procedura comprende quattro fasi distinte. Il primo è la preparazione di sezioni dal materiale FFPE e microdissezione di cellule di interesse. Nella seconda fase le cellule isolate vengono lisate e trattati con &#39;filtro aided preparazione del campione&#39; (FASP) tecnica. In questa fase, le proteine ​​sono esaurite da reagenti utilizzati per la lisi del campione e vengono digeriti in due fasi usando endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni digestione, i peptidi sono raccolti in frazioni separate e il loro contenuto viene determinato utilizzando una misurazione di fluorescenza altamente sensibile. Infine, i peptidi vengono frazionati su microcolonne &#39;pipetta a punta. I lysC-peptidi sono suddivise in 4 frazioni, mentre il pe tritticoptides sono separati in due frazioni. In questo modo i campioni preparati permettono di analizzare proteoma da piccole quantità di materiale ad una profondità di 10.000 proteine. Così, il flusso di lavoro descritto è una tecnica potente per studiare malattie in un livello di sistema-moda così come per l&#39;identificazione di potenziali biomarcatori e bersagli farmacologici.

Analisi proteomica di materiale FFPE richiede metodi affidabili e riproducibili per la preparazione del campione. In questa pubblicazione si dimostra un protocollo che permette un efficace isolamento di popolazioni cellulari dal materiale fisso e la loro trasformazione chimica con conseguente elevata purezza frazioni peptidiche che possono essere utilizzati direttamente per l&#39;analisi LC-MS/MS. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi (Figura 1). Nella prima fase del procedimento campioni FFPE sono sezionati con un microtomo e montati su membrana rivestita diapositive. Per aumentare l&#39;adesione tra le sezioni di tessuto e la superficie della membrana diapositiva è necessario per irradiare la superficie del vetrino con luce UV. A questo scopo si usa la luce di una lampada UVintegrato in un banco di coltura cellulare. Dopo questa fase i vetrini sono sottoposti a lavaggi permettendo la rimozione di paraffina e reidratazione dei campioni. Il materiale reidratato è macchiato con ematossilina per un breve periodo. Ciò si traduce in una debole colorazione del campione ma è sufficiente per la visualizzazione delle aree campione per microdissezione. La colorazione deve essere interrotta rapidamente risciacquando dei vetrini con un eccesso di acqua. Una colorazione prolungato dei risultati del campione di scarsi rendimenti peptidici. Nella fase successiva le sezioni essiccati sono sottoposti a microdissezione. La selezione delle aree tissutali di cellule individuali dipende dal tipo di indagine e richiede sempre conoscenze specifiche in istologia o Pathomorphology. Il materiale rilasciato laser viene raccolto su superfici adesive delle provette per il prelievo del campione. Poiché la capacità di legame del materiale adesivo è limitato è necessario trasferire il materiale microdissezione dal coperchio di tegli tubo dopo la dissezione di ogni 3-5 mm 2 del campione. Questo può essere fatto facilmente pipettaggio di pochi microlitri di tampone di lisi tissutale (LTB) sul coperchio e una breve rotazione del tubo in una centrifuga. Dopo che il campione viene raccolto sul fondo della provetta, la microdissezione e la raccolta del campione sul coperchio può essere proseguita. Una volta che l&#39;intero campione viene raccolto i tubi devono essere ulteriormente tappo con parafilm e incubate in un bagno d&#39;acqua a circa 99 ° C con agitazione continua per 1 ora. Poiché durante l&#39;incubazione acqua condensa sul coperchio, ogni 15 min i tubi devono essere poco centrifugato per raccogliere di nuovo l&#39;acqua nel cono tubo. Per ottenere peptidi lisati tissutali vengono elaborati utilizzando l&#39;approccio MED-FASP. In questo metodo le proteine ​​lisati sono esaurite dal detersivo e altre sostanze a basso peso molecolare, carboamidomethylated a residui di cisteina, e poi consecutivamente digeriti con due enzimi DIFferenza nelle loro specificità scissione: endoproteinase lysC e tripsina. Dopo ogni fase di digestione i peptidi sono raccolti in frazioni separate. In questa parte della preparazione del campione è importante continuare a ciascuna delle fasi di centrifugazione fino a oltre il 95% della soluzione inizialmente caricata nell&#39;unità di filtrazione superato la membrana. Analizzando tessuto del colon e del suo cancro abbiamo osservato che questa procedura rendimenti 3-6 pg di peptide per 100 nl (tessuto 100 mg o 10 mm 2 di una sezione di 10 um) del materiale microdissezione (Tabella 1). Poiché la proteina totale estraibile da tessuti è di circa il 10% del peso del tessuto le procedure di estrazione e digestione, congiuntamente, una resa del 30-60% nel rispetto al tessuto fresco originario. Questi valori riflettono perdite della proteina durante la disidratazione e colorazione, microdissezione e ritenzione della porzione del campione non digerito nelle unità di ultrafiltrazione. Poiché l&#39;estrazione e la lavorazione di nontessuto FFPE n-microdissezione comportato proteina-to-peptide-conversione resa del 75% 5 è probabile che le perdite di esempio critiche si verificano durante i passi prima MED-FASP. Una caratteristica importante delle miscele di peptidi ottenuti con tale procedura è la loro elevata purezza che facilita ulteriormente processo di frazionamento peptide frazionamento e l&#39;identificazione spettrometria di massa. Questo è stato recentemente dimostrato da un&#39;analisi di campioni di adenoma colorettale 3. In tale studio circa il 40% degli eventi MS / MS ha portato alla identificazione di peptidi dal tessuto FFPE e portato nella mappatura di fino a 17.000 peptidi per singola analisi LC-MS/MS. I tassi più alti di identificazione sono stati raggiunti solo in analisi delle cellule congelate in vitro in coltura 3. Nelle ultime due parti della intera procedura i peptidi isolati sono quantificati e frazionato su microcolonne pipetta a punta. Poiché la quantità di peptide isolato dal tessuto microdissezione sono esserebassa 10 mg non possono essere quantificati con comunemente usati saggi proteici a base di coloranti. Anche gli A 280 misurazioni UV-spettrale a tali concentrazioni non sono utili a causa della luce effetto di dispersione. Al contrario, le misurazioni di fluorescenza dei residui di triptofano offrono un modo affidabile per la determinazione del contenuto di peptide. Recentemente abbiamo dimostrato che fino a 5.000 proteine ​​da cellule in coltura possono essere identificati in un &#39;colpo solo&#39; 4 ore di analisi LC-MS/MS 7. Tuttavia questo tipo di analisi applicata a tessuti nativi raramente consente l&#39;identificazione di oltre 3.000 mila proteine. Per aumentare la profondità dell&#39;analisi peptidi generati in MED FASP devono essere pre-frazionata prima LC-MS/MS. La separazione micro-colonna SAX base è un metodo semplice ed efficiente frazionamento 10. E &#39;già stato applicato in diversi studi di proteomica compresi quelli analizzando tessuto fissato 5, 8, 9. Il SAX-microcolu &#39;pipetta punta&#39;MNS, e la C 18 - colonne di dissalazione &#39;StageTip&#39; 9 sono facili da preparare. Le colonne sono assemblati impilando di tappi, tagliati dalla SAX o C 18 membrane, in una microlitri punta di pipetta 11 200. Esempi di analisi dei campioni FFPE SAX-frazionata sono mostrati nella Tabella 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50589/50589fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica della procedura. La procedura consiste di quattro parti distinte: (1) preparazione delle sezioni dei campioni FFPE e la sua microdissezione, (2) lisi del campione e l&#39;elaborazione delle proteine ​​mediante approccio MED FASP, e (3) quantificazione e (4) di frazionamento i peptidi. <table border="1" class="jove_content_small" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.4in"> Campione </td><td fo:width="1in"> Esempio di pre-frazionamento / digestione </strong&gt; </td><td fo:width="1in"> Spettrometro di massa utilizzato </td><td fo:width="1.25in"> Resa Peptide ng campione / nL (± SD) </td><td fo:width="1.25in"> Proteine ​​Identificazioni univoco per ogni singolo campione </td><td fo:width=".75in"> Riferimento </td></tr><tr><td> • Adenonocarcinoma • mucosa colica normale </td><td> SAX / un enzima </td><td> Orbitrap-Velos </td><td> 36 ± 11 (n = 8) 30 ± 8 (n = 8) </td><td> 5985 ± 54 5868 ± 110 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> • colon Adenoma </td><td> SAX / due enzimi </td><td> Q Exactive </td><td> 56 ± 6.1 (n = 3) </td><td> 9501 ± 28 </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Rappresentante dei risultati delle analisi proteomica del tessuto microdissezione FFPE.

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Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

In formalina archivio fisso e paraffina (FFPE) campioni clinici sono materiale prezioso per le indagini di malattie. Qui mostriamo un flusso di lavoro di preparazione del campione che consente un&#39;analisi approfondita proteomica del tessuto FFPE microdissezione.

Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

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Research

JoVE Journal

Biology

27.4K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry.  In formalina archivio fisso e paraffina (FFPE) campioni clinici sono materiale prezioso per le indagini di malattie. Qui mostriamo un flusso di lavoro di preparazione del campione che consente un'analisi approfondita proteomica del tessuto FFPE microdissezione. 

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Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Ricerca

Biologia

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blotting: la preparazione dei campioni di rilevamento

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione per tessuti renali fissati in formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR è un metodo sensibile e rapido per il rilevamento del DNA Cytomegaloviral in fissato in formalina, incluse in paraffina biopsia

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

The goal of this video is to demonstrate how to perform&#160;automated DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) reference standard cell lines and digital droplet PCR&#160;(ddPCR) analysis to detect rare mutations in a clinical setting. Detecting mutations in FFPE samples demonstrates the clinical utility of ddPCR in FFPE samples.

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...