Riconosciamo l&#39;aiuto fornito da Lourdes Delta Arrueta Antequera (Dipartimento di Entomologia, Ohio State University / OARDC, Wooster, OH) nella configurazione degli esperimenti. Ringraziamo il Dott. Teresa Polonia (USDA, Servizi forestali, NRS) per inviare i campioni EAB larvale. Aiuto fornito dal Dr. Luis A Canas e Nuris M Acosta con la configurazione microscopio è apprezzato. Il finanziamento per questo progetto è stato fornito da fondi statali e federali assegnare alle agricola dell&#39;Ohio Centro Ricerca e Sviluppo, The Ohio State University.

Il protocollo completo di diversi passaggi è raffigurato nel diagramma di flusso nella Figura 1. Singole fasi che costituiscono la dissezione, l&#39;estrazione di RNA, la sintesi Strand Prima cDNA e qRT-PCR sono descritti di seguito. I. larvali Dissection <ol><li> Prima dell&#39;inizio di questa procedura, posto piralide cenere Smeraldo, o EAB, larve su una carta assorbente umida fino dissezioni vengono eseguite. Mantenere fresco preparato 1X tampone fosfato salino, o PBS, sul ghiaccio per mantenere il freddo del buffer durante la dissezione. </li><li> Per iniziare, fissare le larve EAB sul piatto dissezione con perni dissezione fine. Quindi, aggiungere a freddo PBS 1X alla piastra di dissezione. </li><li> In primo luogo, decapitare le larve con un bel paio di forbici dissezione. Successivamente rimuovere l&#39;ultimo segmento addominale delle larve. </li><li> Usando un paio di pinze orologiaio, sollevare la cuticola dalla carcassa larvale. Poi, fare un&#39;incisione per tutta la lunghezza della carcassa con un paio di forbici. Fare attenzione a non rompersi l&#39;intestino, come l&#39;incisione è fatto. </li><li> Con attenzione isolare il tessuto midgut da altri tessuti come i corpi grassi e tessuto connettivo. Poi, lavare il tessuto in acqua dolce tampone PBS 1X per garantire che non vi è contaminazione di fatbody. Trasferire il midgut isolato a 500 ml di pre-raffreddata reagente Trizol in una provetta 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Prossimo, isolare il tessuto grasso corporeo con pinze e trasferirlo in una provetta 1,5 ml eppendorf contenente 500 ml di freddo reagente Trizol. </li><li> Infine, isolare il tessuto cuticola dalla carcassa larvale da rottamazione fuori qualsiasi tessuto aderente, avendo cura di non danneggiare l&#39;integrità del tessuto. Sciacquare il tessuto isolato cuticola in tampone PBS fresco e trasferirli in una provetta da 1,5 mL eppendorf con 500 microlitri di acqua refrigerata reagente Trizol. </li><li> L&#39;isolato tessuti grassi del corpo, cuticola e dell&#39;intestino possono essere conservati a -80 ° C fino all&#39;estrazione dell&#39;RNA. </li><li> In preparazione per l&#39;estrazione di RNA, ordinare i campioni EAB diverse secondo le fasi di sviluppo. Queste fasi sono di 1 °, 2 °, 3 ° e 4 ° stadi, prepupae e adulti. </li></ol> II. Estrazione di RNA (Come protocollo del produttore per s per l&#39;utilizzo di reagenti Trizol) Omogeneizzazione <ol><li> Per iniziare l&#39;estrazione di RNA, utilizzare innanzitutto pestelli di plastica per omogeneizzare i tessuti nel Trizol contenente 1,5 ml provette Eppendorf. Dopo omogeneizzazione, portare il volume totale di ogni campione a 1 ml con il reagente Trizol. </li><li> Per le fasi di sviluppo, omogeneizzare intero animale in azoto liquido con un mortaio e pestello. Quindi aggiungere una aliquota della omogenato (50 mg) a 1 ml di Trizol. </li></ol> Separazione di fase: <ol start="3"><li> Incubare le provette con 1 ml Trizol per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 200μL di cloroformio per ogni provetta. Immediatamente dopo l&#39;aggiunta di cloroformio, agitare i tubi vigorosamente per circa 15 secondi. Poi, incubare le provette a temperatura ambiente per un ulteriore 2-3 minuti. </li><li> Avanti, centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 minuti a 2 ° C. Dopo la centrifugazione, l&#39;RNA sarà nella fase acquosa. Il volume della fase acquosa deve essere 600 microlitri, o 60% del volume totale Trizol. </li></ol> RNA precipitazioni <ol start="6"><li> Rimuovere con cura solo la fase acquosa. Presenza di sostanze al di sotto della fase acquosa provoca la contaminazione del RNA estratto. Poi, il trasferimento della fase acquosa in un tubo opportunamente etichettato 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Per precipitare l&#39;RNA dalla fase acquosa, mescolare 0,5 ml di alcool isopropilico per ogni provetta. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo l&#39;incubazione, centrifugare le provette a 12000 xg per 10 minuti a 2 ° C. </li></ol> Lavare RNA <ol start="8"><li> Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dai tubi. L&#39;RNA è presente nel gel-like pellet formata sul fondo della provetta. Lavare il pellet con il 75% di etanolo, aggiungendo almeno 1 ml di etanolo 75% per 1 ml di Trizol. Mescolare nel vortex. Poi, centrifugare le provette a 7500Xg per 5 minuti a 2 ° C. </li></ol> RNA eluizione <ol start="9"><li> Scartare il sopranatante dai tubi. Centrifugare le provette nella centrifuga di nuovo tavolino per 1 minuto. Rimuovere eventuali surnatante in eccesso dal tubo pipettando attento. Lasciare il tubo aperto e lasciare che l&#39;aria pellet asciutto per 5-10 minuti. Fare attenzione a non asciugare il pellet in quanto si riduce significativamente la sua solubilità. </li><li> Dopo l&#39;aria di essiccazione, risospendere il pellet in <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">diethylpyrocarbonate</a> , o DEPC, acqua trattata. La quantità di acqua usata per risospendere il pellet dipende dalla dimensione del pellet. Utilizzare 50 ml di acqua trattata DEPC per un smtutti microlitri pellet o 100 per un pellet grande. Lasciate che il pellet si dissolvono completamente in acqua trattata DEPC spostando la punta della pipetta su e giù parecchie volte. </li><li> Una volta che il pellet si è sciolta, posto il campione a 55 ° C per 10 minuti. </li><li> Poi, misura la concentrazione di ogni campione di RNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop (2 ml di campione di RNA). </li><li> Conservare i campioni di RNA a -80 ° C fino a quando un ulteriore uso. </li></ol> III. First-Strand cDNA Synthesis (Come protocollo del produttore per s utilizzando SuperScript primo kit di sintesi filo da Invitrogen). <ol><li> Per ogni campione di RNA aggiungere quanto segue in un tubo di PCR: <table border="0"><tbody><tr><td> RNA </td><td> x microlitri </td></tr><tr><td> 10mM dNTP mix M </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Oligo (dt) (0,5 mg / mL) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> DEPC acqua trattata </td><td> (8-x) microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale: </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td colspan="2"> Nota: x è il volume di RNA utilizzati per la sintesi del DNA. A seconda della concentrazione del RNA, 2-3 mg di RNA saranno utilizzati per ogni reazione e il volume totale di ogni reazione deve essere di 10 microlitri. </td></tr></tbody></table></li><li> Mettere la miscela sopra reazione in un termociclatore a 65 ° C per 4 minuti. </li><li> Rimuovere i tubi dal theromocyler e disporli sul ghiaccio immediatamente per almeno 2 minuti. </li><li> Preparare il primo filamento master mix aggiungendo quanto segue: <table border="0"><tbody><tr><td> RT buffer 10X </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 25mM MgCl 2 </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> 0.1M DTT </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> RNasi fuori </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 9 ml di master mix a ciascuna provetta contenente il campione di RNA, mescolare pipeting e centrifugare brevemente miscela. </li><li> Posizionare i tubi indietro nel termociclatore e incubare per 2 minuti a 42 ° C. </li><li> Mettere in pausa il termociclatore e aggiungere 1 ml di Apice II enzima trascrittasi inversa (Invitrogen) in ciascuna provetta. Questo passo dovrebbe essere fatto in fretta. </li><li> Incubare i campioni a 42 ° C per 1,5 ore. </li><li> Terminare la reazione a 70 ° C per 15 minuti. </li><li> Rimuovere i tubi dal termociclatore e disporli sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ml di RNasi H a ciascuna provetta e metterli di nuovo nel termociclatore a 37 ° C per 20 minuti. </li><li> Dopo aver preso i campioni dal termociclatore, aggiungere 20 ml di acqua priva di nucleasi in ciascun tubo. Il volume di ogni campione è raddoppiata in questa fase. </li><li> Controllare la concentrazione di ogni campione con 2 ml di campione. Prendere aliquota di ciascun campione, per rendere la concentrazione di 20ng/μl per l&#39;uso in qRT-PCR. La quantità di acqua per compensare i campioni ad una concentrazione di 20ng/μl dipende dalla concentrazione iniziale del cDNA sintetizzato. </li></ol> IV. qRT-PCR: Primer Progettazione e Determinazione del gene di riferimento <ol><li> Primer design con una temperatura di fusione (Tm) di 60 ° C e una dimensione del prodotto di ~ 100bp. </li><li> AP-PERI1 viene utilizzato come gene di interesse per questo esperimento. Un gene di riferimento o di controllo interno è necessario per la successiva analisi e normalizzazione dei dati. Proteina ribosomiale (AP-RP1) viene utilizzato come gene di riferimento per questo esperimento. </li><li> Preparare 5um scorte di lavoro del primer che verranno utilizzati, tra cui il gene di riferimento. </li></ol> Elaborazione di norme <ol start="4"><li> Per calcolare l&#39;efficienza dei primers utilizzati gli standard dovrebbero essere fatti. </li><li> Fai un mix di cDNA da diversi campioni che saranno testati. </li><li> Fai 5X diluizioni seriali per ogni punto desiderato nel grafico. Quattro diluizioni dovrebbe essere sufficiente, ma cinque sono altamente raccomandati. </li><li> Il volume può variare a seconda di quanti punti e quante tecnico replica vengono utilizzati. Ci dovrebbe essere abbastanza per fare uno standard per ogni gene in fase di test tra cui il gene di riferimento. </li></ol> Piastra modello <ol start="8"><li> Progettare un modello indicante il nome del campione per ciascun bene nel qRT-PCR piatto. Ricordati di includere standard per ogni gene e almeno due tecnici repliche per campione. </li></ol> Impostare i parametri di ciclismo <ol start="9"><li> Girare la qRT-PCR macchina e immettere i parametri ciclismo. I parametri di ciclismo per questo esperimento è la seguente: Fase 1: <ul><li> 1 ciclo: 95 ° C 3 min </li></ul> Fase 2: <ul><li> 40 cicli: 95 ° C 15 sec seguiti da 60 ° C 30 sec (Opzionale: per la determinazione della curva di fusione comprende le seguenti fasi) </li></ul&gt; Fase 3: <ul><li> 1 ciclo: 95 ° C 1 min </li></ul> Fase 4: <ul><li> 1cycle: 55 ° C 1 min </li></ul> Fase 5: <ul><li> 81 cicli: 55 ° C 30 sec </li></ul></li></ol> Piastra impostato per CFX96 (BioRad) macchina <ol start="11"><li> Preparare la master mix per ogni gene (tra cui il gene di riferimento) in tubo separato. Per ogni bene, il master mix è composto da <table border="0"><tbody><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 2μl </td></tr><tr><td> 2,5 X SYBR green </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Primer forward </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Primer retromarcia </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 8 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Mentre si prepara la master mix includono 1-2 reazioni in più per tenere conto di errori di pipettamento. </li><li> Secondo il modello precedentemente progettato, aggiungere 2 microlitri (20 ng / mL) di cDNA in ciascun pozzetto. Poi, aggiungere 8 microlitri della master mix in ciascun pozzetto, risultando in un volume totale di 10 L per reazione. </li><li> Pipetta su e giù (2-3X) per assicurarsi che il campione sia ben amalgamato. Controllare che nessun liquido rimane sulla punta. Per evitare la contaminazione crociata, utilizzare una nuova punta per ogni campione. </li><li> Una volta che l&#39;intera piastra è configurato, coprire il piatto con del nastro ottica. Evitare di toccare il nastro come la presenza di grasso possono influenzare la lettura. Poi, centrifugare la piastra a 500 rpm per 1 minuto per garantire che tutti i prodotti nei pozzi si trovano in fondo della piastra. </li><li> Dopo la centrifugazione, controllare che non ci sia ghiaccio o acqua sul fondo del piatto. Infine, posizionare la piastra nella qRT-PCR macchina ed eseguire il programma PCR. </li></ol> V. Rappresentazione schematica del Experiment <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Diagramma raffigurante l&#39;ordine sequenziale dei passaggi per lo studio dell&#39;espressione genica. <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: A) larvale dissezione EAB mostrando midgut nel mezzo. B) midgut isolati di larvale EAB <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: A) I valori medi espressione relativa (giri) per un peritrophin gene (AP-PERI1) in diversi tessuti tra cui cuticola larvale (Cu), dell&#39;intestino (MG) ​​e corpi grassi (FB). Una specifica EAB proteina ribosomiale (qui chiamato, AP-RP1) è stato utilizzato come controllo interno per normalizzare i dati ottenuti per il gene di interesse, AP-PERI1. B) Variazione relativa piega di AP-PERI1 larvale nei tessuti. Il tessuto cuticola ha mostrato la minima espressione e, pertanto, è stato preso come il calibratore (1X) campione (Pfaffl, 2001). <img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: A) I valori medi espressione relativa (giri) per un peritrophin gene (AP-PERI1) nelle varie fasi di sviluppo di EAB tra cui stadi larvali (1a, 2a, 3a e 4a), prepupae (PP) e adulti (A). Un EAB specifica proteina ribosomiale (AP-RP1) è stato utilizzato come controllo interno per normalizzare i dati ottenuti per il gene di interesse, AP-PERI1. B) Variazione relativa piega di AP-PERI1 in vari stadi di sviluppo. Il campione PP ha mostrato il livello minimo dei livelli di mRNA e quindi è stato preso come il calibratore (1X campione). VI. Conclusione Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) è un efficace strumento per diagnosticare i livelli di mRNA nei tessuti degli insetti diversi e fasi di sviluppo. Inoltre, qRT-PCR è stata per lo più lo strumento chiave per convalidare i dati generati da analisi di espressione genica di alta velocità come microarray e la nuova generazione di RNA-Seq.

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	<li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritrophic+matrix+structure+and+function.">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li><li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly,+Mayetiola+destructor+[Say].">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li><li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol.">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li><li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR.">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li><li>Tellam, R. L., Lehane, M. J., Billingsley, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biology of the Insect Midgut. , 86-114 (1996).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I cicli soglia (Ct) il valore si ottiene per ogni campione in qRT-PCR piatto. Per fare la curva standard, il valore Ct ottenuti per ogni diluizione è stato in funzione del log della sua concentrazione. I valori Ct per i campioni sperimentali sono stati poi riportati su questa curva standard di diluizione della serie. Quantità obiettivo sono stati calcolati da separare le curve standard generato per ogni tessuto cioè esperimento e l&#39;espressione dello sviluppo. I valori di espressione relativa (giri) sono stati poi...

analysis of gene expression in emerald ash borer (agrilus planipennis) using quantitative real time-pcr

Emerald cenere piralide (EAB,<em&gt; Agrilus planipennis</em&gt;) È un parassita esotico invasiva, che ha ucciso milioni di alberi di frassino (<em&gt; Fraxinus</em&gt; Spp) in Nord America.<strong&gt;</strong&gt; EAB continua a diffondersi rapidamente e attacchi cenere alberi di diverse età, da alberelli di alberi maturi. Tuttavia, ad oggi poco o nessuna conoscenza molecolare esiste per EAB. Siamo interessati a decifrare i processi fisiologici molecolari basati a livello di tessuto che EAB aiuto nella colonizzazione di successo di frassini. In questo rapporto si mostra l&#39;uso efficace delle quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) per accertare i livelli di mRNA in diversi tessuti larvali (compresi midgut, grasso corpi e cuticola) e varie fasi di sviluppo (di cui 1<sup&gt; St</sup&gt; -, 2<sup&gt; Nd</sup&gt; -, 3<sup&gt; Rd</sup&gt; -, 4<sup&gt; °</sup&gt;-Stadi, prepupae e adulti) di EAB. A titolo di esempio, un gene peritrophin (di seguito chiamato,<em&gt; AP-PERI1</em&gt;) È esemplificata come il gene di interesse e una proteina ribosomiale (<em&gt; AP-RP1</em&gt;) Come controllo interno. Peritrophins sono componenti importanti della membrana peritrophic / matrice (PM), che è il rivestimento dell&#39;intestino degli insetti. Il PM ha diverse funzioni tra cui la digestione e la protezione meccanica per l&#39;epitelio midgut.

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) è un efficace strumento per diagnosticare i livelli di mRNA nei tessuti degli insetti diversi e fasi di sviluppo. In questo rapporto si mostra l&#39;uso di qRT-PCR per accertare i livelli di mRNA in diversi tessuti larvali e gli stadi di sviluppo delle specie di insetti invasivi, smeraldo piralide cenere.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

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Research

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Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

10.6K Views.  The Ohio State University. Quantitativa real-time PCR (QRT-PCR) è un efficace strumento per diagnosticare i livelli di mRNA nei tessuti degli insetti diversi e fasi di sviluppo. In questo rapporto si mostra l'uso di qRT-PCR per accertare i livelli di mRNA in diversi tessuti larvali e gli stadi di sviluppo delle specie di insetti invasivi, smeraldo piralide cenere.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Analisi globale di RNA Sintesi a livello di singola cellula seguente ipossia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...