1. La Thermo Scientific Solaris qPCR analisi la progettazione di algoritmi <ol><li> L&#39;algoritmo utilizzato nella progettazione di Solaris qPCR sonda / primer coppie regola la Tm di ogni componente consentendo in tal modo condizioni di ciclismo universale. Scanalatura incorporazione della MGB, o minore vincolante, molecola nella sonda aumenta il Tm e permette di brevi sonde devono essere progettati per una maggiore flessibilità di analisi e prestazioni. Come il loro nome, MGBs sono una classe di antibiotici che possono adattarsi al solco minore della doppia elica del DNA. MGBs sono attaccati fino alla fine 3 o 5 di una sonda di DNA. In soluzione, la fluorescenza giornalista FAM della sonda si spegne da Quencher Eclipse Oscuro. Quando la sonda si lega ad una sequenza bersaglio, con conseguente cambiamento di sonda s 3-D conformazione permette un forte segnale fluorescente. Legame della sonda alla sequenza del DNA bersaglio è stabilizzata dal MGB, che consente l&#39;utilizzo di altamente specifico, sonde brevi mantenendo la temperatura adeguata di fusione per la PCR. Così, il rilevamento del segnale si verifica durante la fase di ricottura di amplificazione di destinazione. Durante la fase di estensione, la sonda MGB dissocia e la fluorescenza è di nuovo spenta. Poiché la sonda dissocia, non influenza l&#39;efficienza della PCR. </li><li> Un&#39;altra caratteristica dell&#39;algoritmo Solaris è l&#39;uso di Superbases. Superbases vengono modificati basi che hanno migliorato le capacità vincolante per migliorare la stabilità di AT titoli ed eliminare GG auto-associazione di sequenze ricche in guanina. Inoltre, non spegnere fluorofori adiacente attaccato al capolinea 5. Queste basi sono selettivamente posto, secondo l&#39;algoritmo, per ampliare la disponibilità di sequenze bersaglio. Questo rende possibile l&#39;utilizzo di sequenze, come le regioni ricche in GC, che altrimenti sarebbero evitati nella progettazione di primer e sonde. </li><li> Quando possibile, l&#39;algoritmo di Solaris incorpora regioni di giunzione esone estende nel sito di destinazione. Questo aumenta la specificità, evitando l&#39;amplificazione del DNA genomico contaminante. </li><li> È importante sottolineare che l&#39;algoritmo individua inoltre una sequenza consenso per tutte le varianti di splicing conosciuti, in modo tale che tutti sono coperti da una singola sonda / set primer. Quindi, solo un test è necessario per un particolare gene di interesse. </li><li> Infine, il saggio di Solaris qPCR algoritmo design utilizza dei parametri molto rigorosi per considerazioni di progettazione critici compresi i contenuti GC, lunghezza, Tm, e tratti di nucleotidi omogenea. Le sequenze risultanti sono BLAST analizzati per specificità utilizzando 3 diversi database: genomica, trascrizione, e pseudogene. </li></ol> 2. Ottenere Reagenti Solaris <ol><li> Per ottenere il appropriati reagenti Solaris, visitare <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Una volta sul sito clicca su &quot;Ricerca prodotti GENEius&quot;. Per andare direttamente alla ricerca dei prodotti GENEius, andare a <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Fare clic nella casella richiesta di ricerca e scegliere l&#39;organismo di destinazione appropriata. </li><li> La ricerca dei prodotti GENEius in grado di elaborare molti geni diversi identificativi. Qui, inserire uno dei termini di ricerca ha suggerito di trovare il gene di interesse, tra cui Rif. Seq adesione, l&#39;ID del gene, la sigla del gene, una descrizione Gene, l&#39;ID o il numero di Sanger di adesione, o un numero di catalogo. Quindi, fare clic su &quot;Cerca&quot;. </li><li> Identificare il gene di interesse e cliccare su &quot;Seleziona&quot; sul lato sinistro. Si aprirà una finestra che mostra i diversi prodotti Thermo Scientific disponibile per il gene di interesse. Nella sezione &quot;Prodotti&quot; selezionare l&#39;opzione &quot;Rilevazione qPCR&quot; Tab. </li><li> Sotto il &quot;Saggio di espressione genica Solaris&quot; voce, vedrete uno ottimamente progettato Solaris sonda / test primer. Questo saggio sarà coprire tutte le varianti di splicing note del gene bersaglio. Scegli la quantità desiderata. Sono disponibili in 100, 200, 400 e 1000 X 25 microlitri reazioni (se il test è identificato come made-to-order, i 100 confezioni non saranno disponibili). Clicca su &quot;Aggiungi al carrello&quot;. </li><li> Quindi, selezionare la combinazione appropriata master per il termociclatore che verrà utilizzato. Per determinare quale master mix funzionano meglio con la macchina a disposizione, clicca su &quot;Scopri quali Master Mix funziona meglio con il vostro Cycler PCR!&quot; </li><li> Trova la cycler qPCR che verrà utilizzato nel menu per determinare quale mix da usare. </li><li> Tornare alla finestra di ricerca dei prodotti GENEius, e selezionare il mix appropriato master. Il master mix è disponibile in 100, 200, 400 e 1000 misure di reazione. Fare clic su &quot;Aggiungi al carrello&quot;. </li><li> Geni di riferimento proposti e kit di sintesi verso cDNA possono essere ordinati anche per un completo qRT-PCR. </li><li> Quando i reagenti qPCR Solaris arrivare, conservarli a -20 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. I seguenti reagenti devono essere ricevuti: A 20X soluzione contenente due primer fornito a 800 nm ciascuno e una sonda gene specifico fornito a 200 nm, sequinformazioni di riferimento sia per la sonda e il primer, e Solaris Mix Gene qPCR Espressione Maestro ad una concentrazione 2X. Solaris qPCR saggi di espressione genica sono stabili per un minimo di 12 mesi. Evitare di congelare e scongelare ripetuti. </li></ol> 3. qPCR configurazione <ol><li> Iniziare il protocollo qPCR con cDNA. L&#39;RNA totale dovrebbe essere estratti utilizzando un metodo di colonna. La Thermo Scientific kit di sintesi Verso cDNA è raccomandato per la trascrizione inversa per generare cDNA. </li><li> Preparati per qPCR da scongelamento del primer, sonde e master mix su ghiaccio. Anche avere a disposizione acqua di qualità PCR e opaco qPCR piatti bianchi, che può migliorare la sensibilità di PCR in tempo reale. </li><li> Il master mix contiene tutti i componenti per PCR in tempo reale tra cui: 1) Termo-Start DNA polimerasi, un hot-start versione di DNA polimerasi Thermoprime. Questo tipo di polimerasi è usato per prevenire le non-specifica amplificazione durante la reazione di set-up e richiede fase di attivazione a 95 ° C 15 min. 2) dNTP nel mix Solaris Maestro, dTTP sostituisce dUTP per massimizzare l&#39;efficienza dell&#39;amplificazione 3) tampone di reazione di proprietà, ottimizzato per lavorare con Solaris primer / sonda test. Questo tampone di reazione contiene colorante blu per aumentare il contrasto tra il reagente e plastica. 4) ROX, se il vostro strumento qPCR richiede ROX. </li><li> Una volta che le soluzioni sono scongelati, mescolare sfogliando il tubo (non vortex). Spin giù per evitare perdite di reagente. </li><li> Successivamente, preparare una provetta sterile 15 ml Falcon per impostare la miscela di reazione per il gene di interesse, più uno per il gene di riferimento, scaling up a seconda del numero di campioni. Preparare sufficiente tale che tre repliche possono essere preparati per ogni campione, tra cui un modello di alcun controllo (NTC) e campioni curva standard, se il metodo di curva standard verrà utilizzato per l&#39;analisi. </li><li> Per ogni campione eseguito su una piastra da 96 pozzetti, mescolare i seguenti: 5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 0,5 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l&#39;acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta il cDNA viene aggiunta saranno 25 microlitri. Per ogni campione eseguito su un piatto ben 384 mescolare le seguenti: 12,5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 1,25 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l&#39;acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta che il cDNA si aggiunge saranno 10 L. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire il master mix nei rispettivi pozzetti della piastra. Il colorante blu inclusi nel master mix sarà di aiuto in corso pipettaggio monitoraggio sui piatti bianchi. Quindi, aggiungere il modello 1-5 microlitri cDNA (per una piastra 96 ​​pozzetti) o 1-2 ml di modello di cDNA (per un piatto ben 384). Pipetta su e giù per mescolare. Porre la piastra in una centrifuga e spin giù per rimuovere eventuali bolle, in quanto questi interferiscono con le letture fluorescenza. </li><li> Programmare il termociclatore: L&#39;enzima deve essere attivato con un 95 ° C 15 minuti (1 ciclo). Poi 40 cicli di 95 ° C, denaturazione per 15 secondi, e la ricottura e l&#39;estensione a 60 ° C per 60 secondi. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma. </li></ol> Rappresentante risultati qPCR con Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Test Solaris dare un rilevamento affidabile anche a concentrazioni molto basse di ingresso, a giudizio l&#39;efficienza della PCR e dei valori r2. Dieci 10-diluizioni di cDNA sintetizzato da sintetici sequenza amplicone RNA o amplicon sequenza di DNA è stato amplificato su uno strumento ABI 7900HT utilizza Solaris saggio qPCR espressione genica per F2RL1 o CDC20, rispettivamente. Il registro su scala curve di amplificazione e curve standard sono indicati con le prestazioni di ciascun saggio tra cui l&#39;efficienza, il valore r2, gamma dinamica su 10 log10 diluizioni, e il limite inferiore di rilevamento. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Saggi Solaris dare risultati consistenti anche tra diversi ricercatori e laboratori. siRNA targeting ALDOA e PPIB, così come un controllo non-targeting (NTC), sono state trasfettate in cellule HeLa a nM 100, 10, 1 e 0,1 concentrazioni finali. Le cellule sono state raccolte e RNA totale isolato 48 ore post-trattamento. cDNA è stato sintetizzato con Thermo Scientific cDNA Synthesis Kit Verso. Un&#39;aliquota del cDNA è stato amplificato in due laboratori geograficamente separati usando Solaris qPCR saggi di espressione genica per il rilevamento di ALDOA, PPIB, e GAPDH su un LightCycler Roche 480 (384 pozzetti) piattaforma. Knockdown è stato calcolato con il metodo ΔΔCq (normalizzata a GAPDH di riferimento dei geni e cellule trattate con NTC). Gli stessi livelli di knockdown sono state dimostrate per entrambi i target genico tra le due ricercatori in entrambi i siti.

Gli autori di questo articolo sono dipendenti di Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris saggi qPCR forniscono un metodo semplice e migliore per l&#39;esecuzione di analisi qPCR. Utilizzando un algoritmo di alto rigore, incorporando la tecnologia e MGB Superbases, questi set di primer e sonda massimizzare la fedeltà e la robustezza degli esperimenti qPCR. Un set di primer e sonda riconosce tutte le varianti di splicing nota di un dato gene. Il sito di destinazione, quando possibile, comprende le regioni esone spanning, per garantire che il DNA genomico non è amplificato. Queste caratteristiche permettono di eseguire numerosi campioni contemporaneamente, riducendo notevolmente la quantità di tempo necessario per eseguire esperimenti complessi. Poiché il master mix è blu, è possibile utilizzare piatti bianchi opachi, che migliorano la sensibilità del qPCR, senza perdere di pipettaggio. Presi tutti insieme, le caratteristiche di progettazione del saggio Solaris qPCR rendono questo saggio qPCR romanzo un test semplice, ma ad alte prestazioni che è specifica e robusto.

quantitative real-time pcr using the thermo scientific solaris qpcr assay

Il gene Solaris qPCR analisi di espressione è un nuovo tipo di primer / sonda set, progettato per semplificare il processo di qPCR pur mantenendo la sensibilità e la precisione del dosaggio. Questi primer / probe set sono già progettati per&gt; 98% del genoma umano e del mouse e miglioramenti caratteristica significativa dalle tecnologie disponibili in precedenza. Questi miglioramenti sono stati resi possibili in virtù di un algoritmo di design innovativo, sviluppato da Thermo Scientific esperti di bioinformatica. Diverse funzioni utili sono state incorporate nel saggio Solaris qPCR per snellire il processo di esecuzione quantitativa real-time PCR. In primo luogo, il protocollo è simile a quello comunemente impiegato alternative, per cui i metodi utilizzati durante qPCR sono suscettibili di essere a conoscenza. In secondo luogo, la master mix è blu, il che rende l&#39;impostazione delle reazioni qPCR più facile da monitorare. In terzo luogo, le condizioni cicli termici sono gli stessi per tutte le analisi (geni), che consente di eseguire molti campioni alla volta e riducendo il rischio di errore. Infine, la sonda e la sequenza di innesco informazioni vengono fornite, semplificando il processo di pubblicazione. Qui, dimostriamo come ottenere i reagenti appropriati di Solaris utilizzando la funzione di ricerca GENEius prodotto trovato sul sito web di ordinazione (www.thermo.com / Solaris) e come utilizzare i reagenti per l&#39;esecuzione di Solaris qPCR usando il metodo standard di curva.

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Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Il Solaris qPCR saggi di espressione genica sono nuovi pre-progettati qPCR primer / sonda combinazioni progettato per semplificare il processo di qPCR senza sacrificare la specificità e la robustezza del test.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

quantitative-real-time-pcr-using-thermo-scientific-solaris-qpcr

Research

JoVE Journal

Biology

49.6K Views.  Thermo Scientific Solaris qPCR Products.  日本語 

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and animal tissues (Figure 1). Direct PCR is based on specially engineered Thermo Scientific Phusion and Phire DNA Polymerases, which include a double-stranded DNA binding domain that gives them unique properties such as high tolerance of inhibitors.
PCR-based target DNA detection has numerous applications in plant research, including plant genotype analysis and verification of transgenes. PCR from plant tissues traditionally involves an initial DNA isolation step, which may require expensive or toxic reagents. The process is time consuming and increases the risk of cross contamination1, 2. Conversely, by using Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit the target DNA can be easily detected, without prior DNA extraction. In the model demonstrated here, an example of derived cleaved amplified polymorphic sequence analysis (dCAPS)3,4 is performed directly from Arabidopsis plant leaves. dCAPS genotyping assays can be used to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) by SNP allele-specific restriction endonuclease digestion3. 
Some plant samples tend to be more challenging when using Direct PCR methods as they contain components that interfere with PCR, such as phenolic compounds. In these cases, an additional step to remove the compounds is traditionally required2,5. Here, this problem is overcome by using a quick and easy dilution protocol followed by Direct PCR amplification (Figure 1). Fifteen year-old oak leaves are used as a model for challenging plants as the specimen contains high amounts of phenolic compounds including tannins. 
Gene transfer into mice is broadly used to study the roles of genes in development, physiology and human disease. The use of these animals requires screening for the presence of the transgene, usually with PCR. Traditionally, this involves a time consuming DNA isolation step, during which DNA for PCR analysis is purified from ear, tail or toe tissues6,7. However, with the Thermo Scientific Phire Animal Tissue Direct PCR Kit transgenic mice can be genotyped without prior DNA purification. In this protocol transgenic mouse genotyping is achieved directly from mouse ear tissues, as demonstrated here for a challenging example where only one primer set is used for amplification of two fragments differing greatly in size.

The Direct PCR approach presented here facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified plant and animal tissue.

Genotipizzazione di campioni di piante e degli animali, senza purificazione del DNA Prima

The Direct PCR approach facilitates PCR amplification directly from small amounts of unpurified samples, and is demonstrated here for several plant and ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Le misurazioni in tempo reale delle Membrane Protein: recettore interazioni Uso risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...