<p class="jove_title"> La reazione della trascrittasi inversa </p><p class="jove_content"> Girare blocco riscaldamento a 70-80 ° C e 42 ° C. Bagni di acqua può essere utilizzata anche in questo passaggio. Se si utilizza blocchi di riscaldamento, mettere un po &#39;d&#39;acqua in modo che il calore è uniforme. </p><ol><li> Adescamento di reazione <ol><li> Prendete 3 g di RNA </li><li> Regolare il volume a 13 microlitri con acqua RNasi libero </li><li> Aggiungere 2,5 ml di casuale esamero primer (2mg/ml) </li></ol></li><li> Mescolare bene e incubare a 70-80 ° C per 8 minuti. Poi, posto in ghiaccio per 5 min. </li><li> RT preparare cocktail (14,5 microlitri / RXN): <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td> <strong>Componente</strong> </td><td> <strong>Volume</strong> </td></tr><tr><td> 5X tampone prima parte </td><td> 6 microlitri </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT <br /></td><td> 3 ml </td></tr><tr><td> 25X aminoallyl-dNTP mix </td><td> 1,2 microlitri </td></tr><tr><td> SuperScript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 microlitri </td></tr><tr><td> Acqua <br /></td><td> 2,0 microlitri </td></tr></tbody></table><br /> * Fra le reazioni n, preparare Master Mix per n 0,5 aliquote di cocktail per assicurare che non si esaurirà. <br /><br /></li><li> Aggiungi 14,5 microlitri a reazioni raffreddato. </li><li> Mix (non vortex) e incubare a 42 ° C per 3-4 ore </li><li> I campioni possono essere conservati a -20 ° C se necessario. </li></ol><p class="jove_title"> Idrolizzare l&#39;RNA </p><ol><li> Per ogni campione, aggiungere 3 ml di NaOH 1 N e 0,6 l di 0,5 M EDTA. (Final conc.s = 100mM NaOH, 10mM EDTA) </li><li> Miscelare e incubare a 65 ° C per 10 minuti. </li><li> Neutralizzare con l&#39;aggiunta di 33,6 microlitri HEPES 1M, pH = 7.0 (finale conc .= 500mm HEPES) </li><li> I campioni possono essere conservati a -20 ° C, se necessario. </li></ol><p class="jove_title"> Reazione di purificazione: la rimozione di personalità giuridica aa-dUTP e ammine libero </p><p class="jove_content"> <em>Nota:</em> Questo protocollo di purificazione è modificata rispetto alla PCRpurification Qiagen QIAquick protocollo kit. Il lavaggio del fosfato e buffer di eluizione sono sostituiti i buffer Qiagen fornito perché i buffer Qiagen contengono ammine gratuito che competere con la reazione di accoppiamento Cy colorante. Le colonne dalla mini-prep kit può anche essere usato. </p><ol><li> Miscela di reazione cDNA con 300 ml (o il volume di reazione 5X = 336 mL) di buffer PB (Qiagen in dotazione) e trasferimento alla colonna QIAquick. </li><li> Porre la colonna in un tubo di raccolta da 2 ml (Qiagen in dotazione) e centrifugare a ~ 13.000 rpm per 1 minuto. Raccolta tubo vuoto. </li><li> Per lavare, aggiungere 750 microlitri di tampone di lavaggio fosfato (non è Qiagen) alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 rpm per 1 minuto. </li><li> Svuotare il tubo di raccolta e ripetere il lavaggio 750 microlitri e fase di centrifugazione. </li><li> Svuotare il tubo di raccolta e centrifugare la colonna un ulteriore 1 minuto a velocità massima. </li><li> Trasferimento colonna in una nuova provetta da microcentrifuga 1,5 ml e con cautela, 30 microlitri di buffer di eluizione fosfato. (Vedi sezione preparazione soluzione) </li><li> Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Eluire per centrifugazione a ~ 13.000 rpm per 1 minuto. </li><li> Eluire una seconda volta (con un altro 30 microlitri di tampone fosfato eluizione) nel tubo stesso ripetendo i passaggi 6-8. Il volume di eluizione finale dovrebbe essere ~ 60 microlitri. </li><li> La quantità di cDNA può essere quantificata in questa fase: <br /> ng = cDNA (fattore di diluizione) (OD260) (37) (volume totale eluito dalla colonna) </li><li> Campione secco a una velocità di vac a 45 ° C. </li><li> I campioni possono essere conservati a -20 ° C se necessario. </li></ol><p class="jove_title"> Accoppiamento aa-cDNA a Cy Ester Dye </p><ol><li> Risospendere aminoallyl cDNA marcato con 10 microlitri 50 mM Na-bicarbonato, pH = 9,0, se necessario. (Questo buffer dovrebbe essere preparata fresca ogni due settimane) </li><li> Lavorare in un luogo buio, aggiungere la sonda a un tubo del colorante Cy appropriato. Pipettare volte su e giù parecchie per sospendere di nuovo il colorante. </li><li> Incubare la reazione per 1 ora al buio a temperatura ambiente. (Incubazione può arrivare fino a due ore) </li></ol><p class="jove_title"> Reazione Purificazione II: la rimozione di colorante disaccoppiato </p><ol><li> Per la reazione di aggiungere 35 microlitri NaOAc 100 mM pH 5.2. Mescolare accuratamente. </li><li> Aggiungere 250 microlitri (o il volume di reazione 5X = 225 mL) tampone PB (Qiagen in dotazione) per ogni campione e mescolare pipettando su e giù. </li><li> Inserire una colonna di spin QIAquick in un tubo di raccolta di 2 ml (Qiagen in dotazione), applicare il campione alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 per 1 minuto. Raccolta tubo vuoto. </li><li> Per lavare, aggiungere 0,75 ml di tampone PE (Qiagen in dotazione) alla colonna e centrifugare a ~ 13.000 per 1 minuto. </li><li> Ripetere il punto 4. </li><li> Raccolta tubo vuoto e colonna centrifugare per un altro 1 minuto alla massima velocità. </li><li> Colonna Mettere in una provetta da microcentrifuga pulito 1,5 ml e con cautela, 30 microlitri tampone EB (Qiagen in dotazione) per il centro della membrana colonna. </li><li> Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Eluire per centrifugazione a ~ 13.000 rpm per 1 minuto. </li><li> Eluire una seconda volta nel tubo stesso ripetendoi passaggi 7-9. Il volume finale eluiti dovrebbe essere ~ 60 microlitri. </li></ol><p class="jove_title" align="left"> Analisi di reazione di marcatura </p><p class="jove_content" align="left"> La quantità di cDNA e l&#39;etichetta può essere quantificata in questa fase: </p><ul><li> Misura OD 260, 550 e 650 (Blank è l&#39;acqua.) Utilizzare il programma NanoDrop microarray. </li><li> Calcolare la pmol di costituzione coloranti e DNA e nuc pmol / colorante rapporto con le equazioni sotto riportato: <br /><br /> nucleotidi pmol = [OD260 volume * (mL) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul><p class="jove_content"> <em>Nota:</em> 1 OD260 = 37 ng / mL per cDNA; 324,5 pg / pmol peso molecolare medio di un dNTP) <br /> pmol di Cy3 OD550 * = volume (mL) / 0.15 <br /> pmol Cy5 OD650 * = volume (mL) / 0.25 <br /> nucleotidi / rapporto colorante cDNA = pmol / pmol Cy colorante </p><p class="jove_content"> Se si utilizza NanoDrop, dà già pmol / mL per ogni tinta. Hai solo bisogno di moltiplicare questo numero per volume di ottenere totale incorporazione pmol colorante. </p><p class="jove_content"> <em>Nota:&gt;</em> 150-200 pmol di costituzione colorante per campione e un rapporto di meno di 20 nucleotidi / molecole di colorante è ottimale per ibridazioni. </p><ul><li> Campioni possono essere conservati a -20 ° C al buio. <ul><li> Combinano sonde di essere ibridato insieme e asciutto nel speedvac a 42 ° C. </li><li> I campioni possono essere conservati a -20 ° C fino al momento di Ibr. </li></ul></li></ul><p class="jove_title"> Pre-Hyb diapositive </p><ol><li> Faccia scivolare verso il basso posto oltre RT 100 ml di acqua in un supporto pulito scivolo rosso per 3-5 minuti </li><li> Scatto secco la diapositiva mettendo a faccia in su di 100 ° C il riscaldamento blocco per alcuni secondi - guarda per la condensazione a sparire </li><li> UV cross-link la diapositiva a 250 mJoules (Inserisci il 2500 a reticolante UV) </li><li> Diapositive idrato per immersione in pre-riscaldato acqua 42 ° C. Spin 5 min a 700 giri a temperatura ambiente. </li><li> Diapositive incubare in vasetto da 50 ml contenente Coplin preriscaldata pre-Ibr (5XSSC, BSA 1%, 0,1% SDS) per almeno 45 minuti a 42 ° C, e l&#39;incubazione può andare più a lungo se necessario. <br /><br /> 50 ml di pre-Hyb tampone: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml 5% di BSA, 0,5 ml 10% SDS, 27 ml di acqua <br /><br /></li><li> Immergere i vetrini in pre-riscaldato acqua (42 ° C) e agitare un paio di minuti per eliminare pre-Hyb buffer. </li><li> Sciacquare in isopropanolo e spin 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente, ad asciugare. </li></ol><p class="jove_title"> Preparazione dei campioni per l&#39;ibridazione </p><ol><li> Risospendere sonda in acqua (volume sono riportati di seguito) <br /><br /><table border="0"><tbody><tr><td> Per un totale vol. = 30μl <br /></td><td> Per un totale vol. = 35μl <br /></td><td> Vol .= per un totale di 40μl <br /></td><td></td></tr><tr><td> 19,8 microlitri di acqua <br /></td><td> 23,55 di acqua microlitri <br /></td><td> 27,2 microlitri di acqua <br /></td><td><br /></td></tr><tr><td> 1,5 microlitri </td><td> 1,5 microlitri </td><td> 1,5 microlitri </td><td> 10 mg / ml di DNA dello sperma di salmone (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 microlitri </td><td> 1,2 microlitri </td><td> 1,2 microlitri </td><td> 12,5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 microlitri </td><td> 5,25 microlitri </td><td> 6 microlitri </td><td> 20XSSC (3X finale) </td></tr><tr><td> 3 ml </td><td> 3,5 microlitri </td><td> 4 microlitri </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table><br /> <em>Nota:</em> L&#39;ordine di aggiunta dei reagenti sono importanti. Non preparare master mix. <br /><br /></li><li> Far bollire per 5 minuti, poi girare 5 minuti a 14.000 giri al minuto. Raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li></ol><p class="jove_title"> Ibridazione </p><ol><li> Aggiungere 10-12 ml di SSC 3X per i pozzi della camera di ibridazione su ogni bordo e al centro. </li><li> Aggiungi una scivolata pulita sollevatore per l&#39;area appropriata della diapositiva e delicatamente carico in soluzione di ibridazione (30 -40 microlitri). Ci dovrebbe essere campione aggiuntivo su entrambi i bordi del vetrino. </li><li> Mettere il vetrino nella camera. Serrare le viti e mettere in un bagno di acqua a 65 ° C durante la notte. Non posizionare la camera direttamente sul fondo della vasca d&#39;acqua. Posizionare un blocco sulla parte superiore della camera superiore a tenere tutto a posto. Tenere il coperchio sul bagno in acqua per proteggere i campioni sensibile alla luce. </li></ol><p class="jove_title"> Ibr Lava </p><ol><li> Preparare i buffer seguenti: <ul><li> SSC 1X, 0,05% SDS </li><li> 0,06 X SSC </li></ul></li><li> Dopo la camera di ibridazione dissigillare incubazione. Rimuovere il vetrino dalla camera, facendo attenzione a non disturbare il coprioggetto. </li><li> Per rimuovere coprioggetto, scivoli immergere in un piatto caldo contenente SSC 1X, 0,05% SDS coprioggetto tampone di lavaggio di fronte al fondo del piatto. Il coprioggetto cadranno spostando il lato scorrimento a lato. </li><li> Dopo che il coprioggetto viene rimosso, posizionare il vetrino in un rack con un bagno fresco caldo 1XSSCm 0,05% SDS. Agitare per un paio di minuti </li><li> Trasferimento diapositive più rack per un bagno di 0,06 X SSC. </li><li> Trasferimento diapositive ad un altro ba° di 0,06 X SSC contenente un rack fresca, cancellando la diapositiva su un tovagliolo di carta per rimuovere il più SDS-contenente tampone il più possibile prima di mettere nella vasca da bagno fresco. </li><li> Agitare scivoli per un paio di minuti. </li><li> Girare subito a temperatura ambiente per 5 min a 700 rpm, poi scivola pronti per la scansione. Conservare al buio fino a scansione. </li></ol>

<ol>
	<li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for.">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> <em style='font-style: italic'>Microarrays &amp; TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization</em>. , .</li><li>Gilbert, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+&amp;+Hybridization+of+probed+labels.">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays &amp; Hybridization of probed labels.</a> , .</li><li>Hedge, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II.">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , .</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>AA-dUTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A0410</td>
<td>5-(3-aminoallyl)-2&#x2019;deoxyuridine-5&#x2019;-triphosphate</td>
</tr>
<tr>
<td>dNTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2035-01</td>
<td>100 mM dNTP Set PCR grade</td>
</tr>
<tr>
<td>Random Hexamer primers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>27-2166-01</td>
<td>3mg/mL</td>
</tr>
<tr>
<td>SuperScript III RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>80800444</td>
<td>200U/&#x03BC;L</td>
</tr>
<tr>
<td>CyDye&#x2122;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN5661</td>
<td>Post-Labelling Reactive Dye Pack</td>
</tr>
<tr>
<td>QIAquick</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>28104</td>
<td>PCR Purification kit</td>
</tr>
<tr>
<td>1M K2HPO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KH2PO4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M KPO4</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>To make a 1M Phosphate buffer (KPO4, pH 8.5-8.7) combine:
9.5 mL 1M K2HPO4 and 0.5 ml 1M KH2PO4
</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate wash buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For 100 mL Phosphate wash buffer (5 mM KPO4, pH 8.0, 80% EtOH) mix: 0.5 ml 1 M KPO4 pH 8.5 + 15.25 mL MilliQ water + 84.25 mL 95% ethanol. Wash buffer will be slightly cloudy.
** IMPORTANT: Phosphate wash buffer should be prepared daily.</td>
</tr>
<tr>
<td>Phosphate elution buffer</td>
<td>Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diluting 1 M KPO4, pH 8.5 to 4 mM with sterile water</td>
</tr>
<tr>
<td>Sodium Carbonate Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>(Na2CO3): 0.5M, pH 9.0. Dissolve 4.2 g NaHCO3 in 80 mL of sterile water and adjust pH to 9.0 with 10 N NaOH; bring volume up to 100 mL with sterile water. To make a 50 mM solution for the dye coupling reaction dilute 1:10 with water.
Note: Carbonate buffer changes composition over time; make it fresh every couple of weeks to a month.</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

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