Parte 1: marcatura fluorescente di cDNA Il Cy3 colorante utilizzato nell&#39;esperimento microarray è sensibile alla fotodegradazione. La procedura dovrebbe svolgersi in una minima quantità di luce. Il protocollo di etichettatura è stato adattato dalla BioPrime sistema di etichettatura CGH Array Genomic manuale 1. <ol><li> I reagenti per la reazione di marcatura sono conservati a -20 ° C. Dal BioPrime CGH Array Buffer Genomic sistema di etichettatura Primer disgelo 2.5X casuale, mescolare dCTP 10X e acqua priva di nucleasi. Anche il disgelo Cy3-dCTP colorante. Dopo lo scongelamento, centrifugare brevemente tutti i reagenti prima dell&#39;uso. </li><li> Una reazione etichettatura separata dovrà essere compilato per ogni campione del DNA da analizzare. In un ml 0,6 pareti spesse tubo aggiungere 500 ng di cDNA, 40 microlitri Buffer 2.5X Primer casuale e nucleasi acqua priva di raggiungere un volume totale di 86 microlitri. </li><li> Mescolare bene e centrifugare brevemente. Incubare reazione per 5 minuti a 100 ° C su un termociclatore. </li><li> Trasferire immediatamente la reazione in un bagno di liquami ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Per ogni tubo poi aggiungere 10 microlitri mix dCTP 10X, 2 microlitri 1 mM Cy3-dCTP e 2 microlitri Exo DNA polimerasi Klenow. La DNA polimerasi Exo Klenow dovrebbero essere lasciati nel congelatore fino al momento e deve essere sempre tenuto in ghiaccio. </li><li> Mescolare bene e per breve tempo di reazione centrifuga. </li><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 16 ore in un termociclatore. </li></ol> Parte 2: Precipitazioni di cDNA con etichetta <ol><li> Prima di proseguire nel turno protocollo sul sistema di ibridazione NimbleGen e permettere al sistema di equilibrare a 42 ° C. </li><li> Per ogni reazione, inserire una colonna microcontrollore in una provetta da 1,5 ml. Aggiungere 300 ml 0,1 X. SSC per ogni colonna seguito dal contenuto della reazione di marcatura (100 l). </li><li> Centrifugare la provetta contenente la colonna a 16.100 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Gettare il flusso attraverso, che può essere leggermente di colore rosa, e aggiungere un altro 300 ml 0,1 X. SSC alla colonna. </li><li> Ripetere centrifugazione a 16.100 xg per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Gettare il flusso attraverso e aggiungere un ulteriore 300 ml 0,1 X. SSC alla colonna. </li><li> Centrifugare a 16100 xg per 12 minuti a 4 ° C. </li><li> Gettare flusso attraverso. Il flusso attraverso dovrebbe essere chiaro dopo questo ultimo lavaggio e si dovrebbe essere in grado di vedere il cDNA rosa etichetta sulla colonna. </li><li> Applicare 100 ul nucleasi acqua priva di colonna. Rimuovere colonna dal tubo da 1,5 ml e capovolgere colonna in un nuovo tubo di 1,5 ml. </li><li> Centrifugare a 2300 xg per 2 minuti a 4 ° C. Il cDNA marcato dovrebbero essere reidratati in acqua che si raccoglie sul fondo della provetta. </li><li> Utilizzare un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro secondo le istruzioni del produttore per calcolare la concentrazione del DNA e valutare l&#39;incorporazione colorante calcolando la base per tingere rapporto in cui il nucleotide a Cy3 rapporto è uguale alla A 260 / A 550 rapporto moltiplicato per 23,15. La base di colorante rapporto dovrebbe essere tra 50 e 80. </li><li> Se cDNA se adeguatamente etichettati, aliquota 6 mg di cDNA marcato in un nuovo tubo di 1,5 ml. </li><li> Mescolare in volume di 0,1 X. NaOAc 3 M, pH 5.2 e 1X isopropanolo. Lasciare miscela incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Avanti centrifuga il campione a 16.100 xg per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare attentamente il supernatante senza disturbare il pellet di DNA, che dovrebbe essere di colore rosa. </li><li> Eseguire un lavaggio con l&#39;aggiunta di etanolo 500 microlitri EtOH 70% e mescolare delicatamente per inversione. </li><li> Centrifugare campione a 16.100 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante, invertire il tubo, e consentire il pellet asciugare per 5 minuti. A questo punto il pellet possono essere conservati a -20 ° C se lo si desidera o il protocollo può essere continuato per l&#39;ibridazione. </li></ol> Parte 3: ibridazione La procedura di ibridazione è tratto dal Manuale Roche NimbleGen utente Array per 2 analisi di espressione genica. <ol><li> Sciogliere il pellet in 5 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Una volta che il pellet è sciolto aggiungere componenti ibridazione elencati nella Tabella 1. Componenti sono ibridazione del kit Roche ibridazione NimbleGen. Dopo che tutti i componenti sono aggiunti il ​​volume totale dovrebbe totale di 18 microlitri. Mescolare bene e brevemente girare il tubo per raccogliere il contenuto in basso. </li><li> Il passo successivo è quello di snaturare il cDNA marcato ponendolo su un blocco di calore a 95 ° C per 5 minuti. </li><li> Trasferire immediatamente il tubo al sistema di ibridazione NimbleGen mentre gli array vengono preparati i seguenti passaggi. </li><li> Microarray dovrebbe sempre essere maneggiati con cura e conservati secondo le istruzioni del produttore. Roche NimbleGen consiglia di conservare le loro matrici di espressione al buio con essiccante a temperatura ambiente. </li><li> Caricare l&#39;array in strumento di allineamento di precisione Mixer (PMAT) fornito tra gli accessori serie elaborazione NimbleGen. </li> &lt;li&gt; Caricare un mixer X1 sul PMAT e togliere il nastro adesivo con una pinza. Chiudere il PMAT in modo sicuro. Applicare una pressione al mixer attraverso il buco nel PMAT e aprire lentamente in modo che l&#39;array e mixer svincolarsi dal PMAT. </li><li> Fermamente applicare la pressione con la Brayer intorno alla parte esterna del mixer per assicurare la tenuta alla matrice è completo e per rimuovere eventuali bolle. Posizionare l&#39;array-mixer complesso sul sistema di ibridazione per riscaldarsi. </li><li> Usando una pipetta a spostamento, lentamente, aggiungere 15 ml di campione etichettato nella porta di riempimento. Questo è il foro situato al centro del mixer. Applicare una pressione lenta e costante per la pipetta in modo che il campione si diffonde in modo uniforme attraverso il mixer senza bolle d&#39;aria. Togliere qualsiasi campione in eccesso dai fori porta e la guarnizione oblò con strisce adesive. </li><li> Chiudere il fermo e iniziare a mescolare la soluzione di ibridazione con B programma sul sistema di ibridazione NimbleGen. Microarray permettono di ibridare per 16-20 ore. </li></ol> Parte 4: post-ibridazione Lava e scansione di microarray La procedura di lavaggio e di scansione è tratto dal Manuale Roche NimbleGen utente Array per le analisi di espressione genica 2. <ol><li> Una volta che l&#39;ibridazione è quasi completata la preparazione tamponi di lavaggio come indicato nella Tabella 2. Preriscaldare IA tampone di lavaggio a 42 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li><li> Accendere lo scanner GenePix serie 4000B e consentire lo scanner al caldo per circa 15 minuti prima dell&#39;uso. </li><li> Versare il pre-riscaldato IA tampone di lavaggio in un piatto. </li><li> Rimuovere l&#39;array-mixer complesso del sistema di ibridazione NimbleGen e far scorrere in dima (fornita negli accessori serie elaborazione NimbleGen). Assemblaggio Immergere in pre-riscaldato IA tampone di lavaggio e rimuovere con attenzione mixer peeling lontano da diapositive. </li><li> Rimuovere array da jig e agitare per 15 secondi nel tampone IA lavaggio. </li><li> Trasferire rapidamente array in un rack di scorrimento nella IB Wash Buffer temperatura ambiente. Agitare il rack scivolo vigorosamente per 2 minuti. </li><li> Trasferire il rack di scivolare in Wash Buffer II e agitare per 1 minuto. </li><li> Trasferire il rack di scivolare nel tampone di lavaggio III e agitare per 15 secondi. </li><li> Trasferire l&#39;array nella diapositiva asciugatura centrifuga e gira per 2 minuti per rimuovere tutta l&#39;umidità. Procedere alla scansione. </li><li> Si raccomanda di eseguire la scansione dell&#39;array immediatamente in quanto il colorante è sensibile alla luce e all&#39;ozono. </li><li> Caricare il, codice a barre serie in giù, nello scanner GenePix serie 4000B. </li><li> Aprire il software GenePix Pro e procedere alla scansione di array. La Roche NimbleGen array di espressione genica utilizza una strategia di ibridazione colore. Di conseguenza solo una lunghezza d&#39;onda è necessario per la scansione. Scansione Cy3 segnale di fluorescenza utilizzando il laser a 532 nm. Aprire la finestra di dialogo di impostazione hardware e impostare il valore PMT del laser 532 nm per un valore di 500. </li><li> Nella finestra di dialogo di impostazione hardware, potenza impostata al 100%, dimensione del pixel a 5 micron, le linee di media a 1, e mettere a fuoco la posizione a 0 micron. </li><li> Eseguire una scansione di anteprima e impostare area di scansione. </li><li> Eseguire la scansione. </li><li> Una volta completata la scansione controllare l&#39;istogramma dell&#39;immagine. Idealmente 1e-5 punti normalizzata dovrebbe essere di 65.000 senso che il limite di saturazione ~ 1-2% delle caratteristiche sono saturi. Se i conteggi normalizzati sono meno di 1e-5, aumentare il guadagno PMT e ripetere la scansione della diapositiva. Se i conteggi normalizzati sono maggiori di 1e-5, ridurre il guadagno PMT e ripetere la scansione della diapositiva. </li><li> Una volta completata la scansione salvare l&#39;immagine. Si consiglia di scegliere una convenzione di denominazione standard per le immagini per la facilità di riferimento. L&#39;immagine può essere caricato nel programma di analisi dei dati di preferenza per la normalizzazione dei dati e calcolo dei valori di intensità. </li></ol> Rappresentante Risultati È possibile innanzitutto cominciare a valutare l&#39;efficienza della reazione Cy3 etichettatura fluorescenza del cDNA quando si inizia la lava con 0,1 X. SSC. Durante ogni lavaggio successivo il flusso attraverso dovrebbe diventare meno colore rosa con l&#39;ultimo flusso attraverso chiare. Inoltre, il marcato con Cy3 cDNA prodotto dovrebbe essere visibile sulla colonna durante queste fasi di lavaggio. Se il flusso attraverso è rosa brillante a colori o in mancanza di un medicinale rosa sulla colonna, questa è una buona indicazione che la reazione di marcatura non procedere correttamente. La reazione di marcatura può essere valutata quantitativamente con il NanoDrop ND-1000 spettrofotometro per determinare la concentrazione del DNA marcato e la base al rapporto di colorante (Figura 1). La reazione di marcatura produce regolarmente almeno 10 mg di DNA marcato nel nostro laboratorio. Incorporazione colorante può essere calcolato usando una semplice base / colorante rapporto in cui il nucleotide a Cy3 rapporto è uguale alla A 260 / A 550 rapporto moltiplicato per 23,15. Valori compresi tra 50-80 indicano sufficiente incorporazione colorante nella reazione di marcatura. Se la reazione di marcatura produce una bassa concentrazione di DNA o di incorporazione tinta poveri, ibridazione del campione sul microfonoroarray non è raccomandato e reazione di marcatura deve essere ripetuta. Valutazione della qualità della ibridazione può essere condotto valutando l&#39;istogramma dell&#39;immagine e l&#39;immagine digitalizzata del microarray (Figura 2). Ibridazioni accettabile avrà 1-2% delle caratteristiche saturi (cioè, ottenendo 1e-5 punti normalizzato al limite 65.000 saturazione) con il valore PMT nei pressi 500. Se il valore PMT deve essere regolato drasticamente da 500 a raggiungere 1e-5 punti normalizzato al limite 65.000 saturazione, questo indica generalmente scarsa ibridazione del cDNA marcato al microarray. La qualità dei dati sarà composto, se tale dato è proseguito attraverso l&#39;analisi successive. Qualità ibridazione può anche essere valutata qualitativamente la visualizzazione di immagini dell&#39;array digitalizzata (Figura 3). L&#39;ibridazione Roche NimbleGen Il kit contiene una miscela di oligo allineamento Cy3 e Cy5-etichettati oligonucleotidi 48mer che ibridano le caratteristiche di allineamento sul array. Valutazione qualitativa dell&#39;intensità del oligos allineamento ad altre funzioni sulla matrice permette un controllo di qualità sull&#39;efficienza ibridazione del cDNA fluorescente sul array. A seguito di ulteriori analisi, un grafico a dispersione dei dati analizzati possono essere utilizzati per determinare i livelli relativi di espressione genica e per identificare i geni che sono espressi in modo differenziale tra i campioni (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="Miniatura di Figura 1" /> Figura 1. Uno spettro NanoDrop da cDNA marcato con Cy3. Resa cDNA marcato e l&#39;incorporazione colorante può essere valutato utilizzando un NanoDrop ND-1000 spettrofotometro. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="Miniatura di Figura 1" /> Figura 2. Un istogramma GenePix microarray per la scansione. Qualità del ibridazione può essere valutata analizzando l&#39;istogramma dell&#39;immagine. Ibridazioni accettabile avrà 1-2% delle caratteristiche saturo di 1e-5 punti normalizzato al limite di saturazione 65.000 con il valore PMT nei pressi 500. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un&#39;immagine microarray digitalizzata. Ibridazione qualità può essere valutata osservando l&#39;immagine digitalizzata del microarray. L&#39;immagine deve essere esaminato per la presenza di polvere o di altri fattori di disturbo che vietano la visualizzazione di ogni funzione e, quindi, impedendo calcolo preciso delle intensità di fluorescenza della funzione. L&#39;intensità del oligo allineamento può essere paragonato alle altre funzioni sulla matrice per valutare l&#39;efficienza di ibridazione. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un grafico a dispersione di un esperimento microarray analizzati. L&#39;obiettivo di questa procedura è quello di identificare geni che sono differenzialmente espressi in campioni. Dati di microarray possono essere ulteriormente analizzati e visualizzati in un grafico a dispersione per visualizzare geni che sono differenzialmente espressi. Tabella 1. Componenti da Kit Roche ibridazione NimbleGen da aggiungere per passo ibridazione 2. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Campione (sciolto in acqua) </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Ibridazione Buffer 2X </td><td> 9 microlitri </td></tr><tr><td> Ibr A </td><td> 3,6 microlitri </td></tr><tr><td> Allineamento Oligo </td><td> 0,4 microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 18 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Wash buffer di essere preparati per il lavaggio degli array seguenti ibridazione. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Tampone di lavaggio IA * </td><td> Tampone di lavaggio IB </td><td> Tampone di lavaggio II </td><td> Tampone di lavaggio III </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td><td> 225 ml </td></tr><tr><td> Tampone di lavaggio 10X I, II o III </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25 microlitri </td><td> 25 microlitri </td><td> 25 microlitri </td><td> 25 microlitri </td></tr><tr><td> Volume totale </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td><td> 250 ml </td></tr></tbody></table> * Pre-riscaldamento a 42 ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

Protocolli di microarray molti, compreso quello dettagliato qui, usare tinture fluorescenti come un mezzo per misurare e quantificare l&#39;ibridazione. Il Cy3 colorante fluorescente è sensibile alle foto e degradazione dell&#39;ozono. Si raccomanda che la procedura sia condotta in illuminazione minima. Inoltre, piccole particelle di polvere possono interferire con l&#39;ibridazione e la scansione. Particolare attenzione dovrebbe essere data per assicurarsi che l&#39;area di lavoro è pulito e privo di polvere. <p ...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

Gene microarray tecnologia permette la misurazione quantitativa e profili di espressione genica dei livelli di trascrizione su un genoma base. Gene microarray tecnologia è utilizzata in numerose discipline biologiche in una varietà di applicazioni, tra cui analisi globale dell&#39;espressione genica in relazione alla fase di sviluppo, ad uno stato di malattia, e nelle risposte tossici. Qui, ci sono una dimostrazione di analisi globale dell&#39;espressione genica utilizzando una completa zebrafish specifica piattaforma microarray di oligonucleotidi. La piattaforma microarray di espressione zebrafish contiene 385.000 sonde, 60 paia di basi di lunghezza, interrogando 37.157 con target fino a 12 sonde per ogni destinazione. Per questa piattaforma, tutte le informazioni cDNA e genomiche disponibili per il pesce zebra è stato raccolto da banche dati genomiche diverse tra cui Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), e ZFIN (http://www.zfin.org). Di conseguenza questo array espressione fornisce una copertura completa del trascrittoma zebrafish corrente. I microarray di espressione zebrafish è stato stampato da Roche NimbleGen (Madison, WI). Questa dimostrazione tecnica comprende la marcatura fluorescente di un prodotto di cDNA, l&#39;ibridazione del prodotto etichettato cDNA alla piattaforma microarray e la scansione di array per l&#39;acquisizione del segnale utilizzando la strategia di analisi del colore.

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Microarray gene sono strumenti potenti in profili di espressione genica a livello di genoma. Questa tecnologia ha applicazioni in una varietà di discipline biologiche tra cui la biologia dello sviluppo e tossicologia. In questo video, abbiamo dettaglio un protocollo per l&#39;analisi globale dell&#39;espressione genica utilizzando una completa piattaforma microarray di oligonucleotidi per il pesce zebra.

Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

global-gene-expression-analysis-using-zebrafish-oligonucleotide

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Purdue University. Microarray gene sono strumenti potenti in profili di espressione genica a livello di genoma. Questa tecnologia ha applicazioni in una varietà di discipline biologiche tra cui la biologia dello sviluppo e tossicologia. In questo video, abbiamo dettaglio un protocollo per l'analisi globale dell'espressione genica utilizzando una completa piattaforma microarray di oligonucleotidi per il pesce zebra.

Video: Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Batterica analisi di espressione genica mediante microarray

Ricerca

Biologia

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Isolamento RNA da embrionali Sintesi Zebrafish e cDNA per l&#39;analisi di espressione genica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

Analisi dell&#39;espressione genica in Borer Emerald Ash ( Agrilus planipennis) Utilizzando quantitativa Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

Gene Trapping Utilizzo Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...