Dopo aver eseguito l'imaging delle cellule Hep-3B trattate con il farmaco, aprire le immagini confocali nell'immagine J con il plug-in di colocalizzazione. Aprire il file ND nel server immagine J e selezionare l'opzione dividi canali nella finestra di dialogo. Lavora con immagini verdi e rosse.
Genera duplicati di queste immagini per mantenere intatta l'immagine originale facendo clic sull'immagine e selezionando duplica o utilizzando la scorciatoia da tastiera più D.To ridurre lo sfondo, generare un'altra immagine duplicata, sottrarre lo sfondo con un raggio di rotazione di 100 e selezionare l'opzione crea sfondo per generare un'immagine con lo sfondo delle immagini specificato. Quindi, vai al processo. Fare clic su calcolatrice di immagini e sottrarre la prima immagine duplicata dalla seconda immagine duplicata.
Utilizzare le immagini risultanti per l'analisi di colocalizzazione. Per utilizzare il plug-in di colocalizzazione, convertire le immagini dei canali verde e rosso a 8 bit facendo clic su immagine, selezionando tipo, seguito da 8 bit. Quindi, fai clic su plugin e seleziona la colocalizzazione.
Per misurare la colocalizzazione dei segnali dei mitocondri e dei lisosomi, impostare il rapporto al 75%, il canale rosso soglia a 80,0 e il canale verde soglia a 50,0. Verrà generata un'immagine binaria a 8 bit contenente puncta colocalizzata e combinando le tre immagini a 8 bit in un'immagine RGB. Converti queste immagini in immagini a 8 bit.
Per ottenere l'area di interesse delle celle, generare un'immagine che evidenzi l'area delle celle selezionando l'immagine di un punto colocalizzato. Per selezionare l'intera area della cella, selezionare l'immagine dei punti colocalizzati risultante e fare clic sull'immagine, regolare la soglia e impostare la soglia per assicurarsi che tutta l'area della cella sia evidenziata. Per analizzare l'area della cella, selezionare Analizza, fare clic su Analizza particelle e misurare tutte le particelle nell'immagine da zero a infinito, l'impostazione predefinita per analizzare le particelle.
Per analizzare l'area dei mitocondri e dei lisosomi colocalizzati, selezionare l'immagine colocalizzata a 8 bit. Quindi, seleziona Analizza. Fare clic su Analizza particelle e misurare la somma di puncta tra 0,1625 micrometri quadrati e quattro micrometri quadrati.
Dividere l'area dei mitocondri e dei lisosomi colocalizzati per l'area cellulare totale per misurare la puncta colocalizzata. Le immagini confocali delle cellule Hep-3B hanno mostrato la colocalizzazione dei mitocondri e dei lisosomi. VL 850 e FCCP hanno indotto una significativa mitofagia nelle cellule Hep-3B.
