Preparare la soluzione di ORO sciogliendo 0,5 grammi di polvere di ORO in 100 millilitri di isopropanolo per generare una soluzione madre. Preparare la soluzione di lavoro per tutti i muscoli combinando la soluzione madre ORO e l'acqua deionizzata in un rapporto di 60 a 40. Coprire la soluzione di lavoro per 10 minuti per consentire al particolato di depositarsi.
Filtrarlo attraverso una rete da 40 micrometri, seguita da un filtro per siringa da 0,22 micrometri. Successivamente, rimuovere la soluzione di formaldeide dai muscoli decellularizzati nella piastra a pozzetto e lavare i muscoli tre volte con un volume uguale di PBS. Quindi, sostituire il PBS con un volume uguale di soluzione di isopropanolo al 60% e incubarlo sull'agitatore a dondolo per cinque minuti.
Una volta terminato, sostituire la soluzione di isopropanolo al 60% con la soluzione di lavoro ORO prima di 10 minuti di incubazione sullo shaker a dondolo. Successivamente, sostituire la soluzione di lavoro ORO con un volume uguale di 1%SDS e ispezionare periodicamente la soluzione SDS. Una volta che la soluzione diventa visibilmente rosa, sostituisci la soluzione SDS con una nuova soluzione SDS all'1%.
Quando la soluzione rimane limpida per 24 ore, sostituire l'1%SDS con PBS. Sotto uno stereomicroscopio a quattro ingrandimenti, rimuovere eventuali detriti o particelle evidenti attaccati all'esterno del muscolo colorato. Se la colorazione è soddisfacente, mostrando le sfere rosso vivo che fluttuano in una matrice trasparente, acquisire le immagini di colorazione utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio.
I muscoli correttamente decellularizzati erano bianchi e semitrasparenti. Quando i muscoli decellularizzati sono stati colorati con ORO al tessuto adiposo intramuscolare visualizzato, o IMAT, le goccioline lipidiche IMAT erano evidenti all'interno delle strutture muscolari chiare come sfere rosse. I muscoli sani degli arti posteriori del topo hanno mostrato un po' di IMAT naturale, evidenziato da pochi o nessun lipide rosso o positivo rispetto ai muscoli degli arti posteriori iniettati con tossina cardio o glicerolo.
La decellularizzazione incompleta è stata identificata immediatamente dopo il trattamento SDS iniziale o dopo il dilavamento della colorazione ORO come fibre rosa chiaro semiopache. L'eliminazione incompleta di ORO è stata identificata dopo il washout di ORO come uno sfondo uniforme rosa o rosso piuttosto che linee di fibre distinte.
