Questi protocolli consentono ai ricercatori di andare oltre la semplice misurazione del consumo di ossigeno mitocondriale e consentono invece la misurazione dei principali prodotti finali mitocondriali, ATP e specie reattive dell'ossigeno. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il ricercatore può misurare l'efficienza mitocondriale confrontando direttamente il tasso di consumo di ossigeno con il tasso di produzione del prodotto finale. Se il prodotto finale è ATP o ossigeno reattivo.
Le tecniche richiedono un'attenzione molto attenta ai dettagli, in particolare per evitare le bolle. Che si trovino nella camera di respirazione o nelle siringhe di titolazione, le bolle sono il tuo nemico perché rendono le misurazioni meno precise. Dopo aver ottenuto le biopsie muscolari scheletriche.
Riempire le camere respirometriche con supporti privi di magnesio e sigillare la camera di incubazione. Impostare la temperatura di incubazione dello strumento a 38 gradi Celsius per rappresentare la temperatura basale del muscolo scheletrico equino. E impostare la miscelazione del mezzo di respirazione a 750 giri / min utilizzando un movimento magnetico girando sul fondo della camera respirometrica.
Quindi, spegnere l'illuminazione della camera per evitare interferenze con i sensori fluorescenti. Energizzare l'elettrodo di ossigeno con una tensione di polarizzazione di 800 millivolt e amplificare il segnale risultante con un'impostazione di guadagno di uno. Registrare la concentrazione di ossigeno ogni due secondi e calcolare il flusso di ossigeno come pendenza negativa della misurazione dell'ossigeno nei 40 secondi successivi.
Quindi calibrare il sensore di ossigeno consentendo al fluido di equilibrarsi con l'aria ambiente. Calcolare la pressione parziale dell'ossigeno di riferimento in base alla pressione barometrica misurata dal respirometro ad alta risoluzione e dalla concentrazione standard di ossigeno atmosferico. Utilizzare sensori fluorescenti verdi per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria.
Energizzare i sensori da 400 a 500 millivolt e il segnale risultante viene amplificato con un guadagno da 1 a 1.000. Quindi, aggiungere TMRM alla camera di respirazione prima di aggiungere mitocondri e calibrare il segnale fluorescente utilizzando una semplice calibrazione a due punti del segnale fluorescente rispetto alla quantità di fluoroforo aggiunto prima dell'aggiunta dei mitocondri. Eseguire la calibrazione finale del segnale TMRM dopo il completamento del protocollo di titolazione respirometrica erogando diverse titolazioni dell'agente disaccoppiante fino a quando non si osservano ulteriori aumenti del segnale fluorescente TMRM che indicano il completo collasso del potenziale di membrana mitocondriale.
Utilizzare sensori fluorescenti blu per quantificare il segnale fluorescente dalla camera respiratoria e energizzare questi sensori per i singoli strumenti per catturare il segnale atteso all'interno della gamma lineare del sensore. Aggiungere otto microlitri di EDTA a due millimolari alla camera respiratoria per chelare cationi che competerebbero con gli ioni di magnesio per legarsi al verde di magnesio. Quindi, aggiungere quattro microlitri di un verde di magnesio millimolare alla camera respiratoria.
Calibrare il segnale fluorescente grezzo con titolazioni sequenziali da 10 x 2 microlitri di cloruro di magnesio 100 millimolari, lasciando un minuto tra le titolazioni per stabilizzare il segnale fluorescente. Determinare la velocità di sintesi di ATTP che è la pendenza della concentrazione di ATP nel tempo in tutto il protocollo. Utilizzare sensori fluorescenti verdi per quantificare il segnale fluorescente proveniente dalla camera respiratoria.
Energizzare i sensori da 300 a 400 millivolt. E il segnale risultante viene amplificato con un guadagno da 1 a 1.000. Ottimizza impostazioni specifiche per i singoli strumenti per acquisire il segnale previsto all'interno della gamma lineare del sensore.
Prima di aggiungere i mitocondri, eseguire la configurazione chimica e la calibrazione iniziale del test Amplex UltraRed. Aggiungere 30 micromoli di DTPA ai cationi chelati che potrebbero interferire con la reazione. Quindi aggiungere superossido dismutasi o perossidasi serratus e Amplex UltraRed nella camera respirometrica.
Lasciare stabilizzare il segnale fluorescente. Quindi aggiungere 0,2 micromoli di perossido di idrogeno due volte con un intervallo di cinque minuti. Eseguire ulteriori calibrazioni a due punti durante il test per consentire la regolazione della reattività del saggio man mano che la chimica della respirometria cambia durante il test con la tempistica specifica di questi punti di calibrazione a discrezione dello sperimentatore.
Vortice il campione per mantenere una sospensione uniforme del campione e aggiungere 15 microlitri di sospensione mitocondriale isolata a ciascuna camera di incubazione da due millilitri in modo che i risultati rappresentino la resa mitocondriale di 18,75 milligrammi di muscolo. Prima di aggiungere qualsiasi substrato, misurare il consumo di ossigeno residuo e sottrarre questo valore dai valori di consumo di ossigeno di ogni fase della titolazione dell'inibitore disaccoppiato del substrato o del protocollo SUIT dopo il completamento. Utilizzare una SUIT generica che consenta la caratterizzazione iniziale della funzione mitocondriale del muscolo scheletrico equino.
Inizia con titolazioni sequenziali di piruvato, glutammato e malato l'uno nell'altro in ciascuna camera per produrre nicotinammide adenina dinucleotide e stimolare la respirazione non fosforilante supportata da NADH ossidato attraverso complesse perdite a base unica. Quindi aggiungere ADP per stimolare la respirazione fosforilante attraverso una respirazione fosforilante complessa. Aggiungere succinato per produrre la respirazione fosforilante combinando la respirazione fosforilante complessa e complessa due Aggiungere rotenone per bloccare il complesso.
Il flusso di ossigeno risultante rappresenta la capacità del complesso due di supportare il consumo di ossigeno mitocondriale mediante l'ossidazione del solo succinato. Viene mostrata una traccia respirometrica ad alta risoluzione della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e del relativo potenziale di membrana. I valori respiratori dei mitocondri incubati con TMRM sono più bassi a causa di un effetto inibitorio di quel fluoroforo.
Vengono mostrate la respirazione mitocondriale e la sintesi di ATTP del muscolo scheletrico equino contenente un'alta percentuale di fibre muscolari scheletriche di tipo uno ricche di mitocondri e incubato in condizioni che si avvicinano al metabolismo a riposo. Viene mostrata la traccia respirometrica della respirazione mitocondriale del muscolo scheletrico equino e la produzione di perossido di idrogeno. La respirometria ad alta risoluzione richiede molta pazienza.
La persona che esegue il test avrà numerosi punti temporali in cui deve effettuare una chiamata di giudizio in merito al raggiungimento di uno stato stazionario e al passaggio successivo. Abbiamo dimostrato un solo protocollo di titolazione. Ci sono dozzine di altri protocolli che possono essere applicati allo stesso modo per affrontare domande specifiche riguardanti il metabolismo mitocondriale.
