Questo lavoro è stato sostenuto da RO1-AG028614 a JM, RO1-AR063084to NLW, e RO1-AR057404 a JZ.

1. Impostazione osmotica stress sistema di perfusione La figura 1 è un protocollo schematica di calcio scintille valutazione in fibre muscolari scheletriche intatte. <ol><li> Impostare un tre assi (xyz) micromanipolatore grado di posizionare l&#39;estremità di uscita del sistema di perfusione contenente almeno due canali. Questo potrebbe essere fatto con barilotto monouso Luer-siringa con divisoria tre - vie Luer - Lok rubinetto per accendere e / o spegnere del flusso di soluzioni di perfusione. Questi canali perfusione dovrebbero poter erogare&gt; 1 ml / min di soluzione attraverso una sola punta perfusione con&gt; 0,2 mm di diametro. </li><li> Caricare due canali del sistema di perfusione, uno con isotonica Tyrode soluzione e l&#39;altra con ipotonico Tyrode Solution. </li></ol> 2. Fibre Preparazione intatto singolo flessore Brevis (FDB) muscolari di topo <ol><li> Togliere il piede da un mouse euthanized seguente NIH e IACUC linee guida utilizzando un paio di forbici dissezione pesanti tagliando attraverso la gamba sopra la caviglia. </li><li> Pin il piede su una camera di dissezione pieno di Minimal Ca 2 + Soluzione Tyrode con la superficie plantare rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Sezionare FDB tagliando il tendine e delicatamente tirando la tendine per separare il muscolo dal tessuto circostante. </li><li> Concretizzare dissezione tagliando il tendine distale dove si dirama in singole cifre negli strati profondi del muscolo. </li><li> Trasferire il muscolo FDB prelevando con una pinza attraverso i suoi tendini per evitare ulteriori danni alle fibre muscolari e posto in un tubo con un&#39;aliquota scongelato di Collagenase digestione Solution preriscaldata a 37 ° C. </li><li> Incubare la provetta contenente FDB verticale su un agitatore orbitale a 37 ° C per 60-90 min con una velocità di 160 rpm. Questo protocollo dissociazione fasci muscolari deve essere esaminato sperimentalmente per diversi ceppi di animali, Soprattutto per quelle malattie / fibre mutanti vulnerabili ai danni della membrana. </li><li> Trasferire il digerito FDB nel tubo con 700 ml di soluzione isotonica Tyrode e triturare delicatamente per liberare le fibre disegnando muscolo più volte attraverso una serie di punte 200 ml-micropipetta di diametro via via decrescente tramite taglio con una lama di rasoio pulita per rimuovere le punte 200 ml micropipetta. Per evitare di danneggiare le fibre nei muscoli particolarmente deboli dalla malattia, assicurarsi che la punta è abbastanza grande da permettere il fascio di fibre di passare senza attaccare. Non forzare il fascio attraverso troppo piccolo un&#39;apertura. </li><li> Placcare le fibre FDB delicatamente toccando e risospendere fibre FDB nel tubo e poi estraendo 70 ml (1/10 di fibre totali) con una micropipetta taglio 200 ml al centro di un piatto Delta TPG 35 millimetri contenente 1 ml di isotonica Tyrode soluzione per ridurre la diffusione in tutto il piatto. </li><li> Determinare il numero di intatte singole fibre in dish utilizzando un microscopio di dissezione. Aggiungere ulteriori aliquote di fibre FDB avere 3-4 fibre intatte sul piatto. </li><li> Conservare le fibre muscolari isolate supplementari a 4 ° C ed utilizzare entro 6 ore. </li></ol> 3. Fluo-04:00 Dye Caricamento e Ca 2 + Imaging (Sparks Measurement) <ol><li> Trasferimento 500 ml di soluzione isotonica Tyrode dal piatto con fibre di FDB placcati in una provetta da 10 ml Fluo-04:00 magazzino (1 mm), mescolare e aggiungere di nuovo al piatto per una finale Fluo-4 AM concentrazione di 10 mm. In alternativa, l&#39;acido Pluronic può essere usato per aumentare l&#39;efficienza colorante di caricamento. </li><li> Caricare per 60 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le fibre disegnando con cautela 500 ml di Fluo-4-AM contenente isotonica Tyrode soluzione dal piatto con una uncut 200 ml-plastica punta micropipetta e sostituirlo con uguale volume di fresca isotonica Tyrode Solution. </li><li> Ripetere questa operazione altre 3 volte. </li><li> Per visualizzare la funzione mitocondriale, trasferire 500 ml di Isotonic Tyrode soluzione dal piatto con fibre di FDB in una provetta con 5 ml TMRE magazzino (1 mm), mescolare e aggiungere di nuovo al piatto per una concentrazione finale di 50 nM. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare le fibre disegnando con cautela 500 ml di TMRE contenente isotonica Tyrode soluzione dal piatto con una uncut ml punta micropipetta 200 plastica e sostituirlo con uguale volume di fresca isotonica Tyrode Solution. </li><li> Ripetere questa operazione altre 3 volte. </li><li> Trasferire il piatto al microscopio confocale e selezionare una fibra intatta con striature chiare e una membrana sarcolemmal liscio per la sperimentazione. </li><li> Posizionare la punta del sistema di perfusione 400-500 micron di distanza dalla fibra muscolare bersaglio e fuori centro utilizzando i controlli micromanipolatore. </li><li> Inizia flusso del isotonica Tyrode soluzione per garantire la fibra FDB resta al suo posto. </li><li> Registrare il segnale di fluorescenza di Fluo-04:00 con un obiettivo 40X immersione in olio ed emozionare Fluo-04:00 con unalaser argon (eccitazione lunghezza d&#39;onda di 488 nm) e di emissione registrare segnali (lunghezza d&#39;onda 510-580 nm). L&#39;intensità del segnale fluorescente è proporzionale al livello relativo di concentrazione intracellulare Ca2 + ([Ca 2 +] i). </li><li> Indurre Ca 2 + transitori modificando la pressione osmotica della soluzione extracellulare per produrre stress osmotico sulla fibra. Inizialmente profumato le fibre con una soluzione isotonica Tyrode (290 mOsm) (raccolta di base per 60 sec) e poi con soluzione ipotonica Tyrode (170 mOsm) per 100 sec per indurre gonfiore. Profumato le fibre FDB torna con una soluzione isotonica Tyrode. Generalmente, un solo shock osmotico è applicato ad una singola fibra intatta in un delta piatto TPG e gli eventi di accensione ultimo 10 min per l&#39;acquisizione dati. </li><li> Record localizzazione spaziale di Ca 2 + scintille (Figura 2) con un tempo di serie di XY immagini bidimensionali con velocità di scansione di 166 lps (linee per secondo, e EAlinea ch composta da 512 pixel conseguente 3.08 sec / telaio) per ciascuna condizione di isotonica (1 min), stress ipotonico (100 sec) e stress post-ipotonico (5 min). Segnali negozio per l&#39;analisi offline per valutare la distribuzione e la frequenza di Ca 2 + scintille dopo il completamento della sperimentazione. </li><li> Trovare una nuova fibra su un nuovo piatto e seguire lo stesso protocollo di shock osmotico per indurre Ca 2 + transitori. Utilizzare una modalità (xt) (512 pixel in lunghezza, frequenza di campionamento di 2 scan msec / linea di scansione linea confocale per registrare Ca 2 + transitori per un minuto (cioè 30.000 righe) con la linea di scansione confocale posto direttamente sotto la membrana sarcolemmal (Figura 3 ). Modificare la linea di scansione a diversi piani focali per registrare tre serie sequenziale (a intervalli di 1 min) di linescans per l&#39;analisi della grandezza e cinetica dei singoli Ca 2 + scintille. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Raccogliere un gran numero discansione lineare xt traccia per valutare la morfologia e la cinetica dei singoli parametri di Ca 2 + scintille, vale a dire l&#39;ampiezza (F / F 0; dove F 0 è il riposo di Ca 2 + fluorescenza), tempo di salita, tempo di picco, la durata (FDHM , tutta la durata a metà grandezza), e ampiezza spaziale (FWHM, piena larghezza a metà grandezza) delle scintille registrati. Questi parametri rappresentano le proprietà di gating di base del RYR Ca 2 + canali come il Ca 2 + flux (ampiezza), e la cinetica di comando dei RyRs (durata). </li><li> Analizzare i dati di immagini digitali con un algoritmo semi-automatico personalizzato sviluppato che è stato creato con il linguaggio di elaborazione delle immagini IDL (Interactive Data Language), come descritto in precedenza 11,16. Poiché la cinetica uniche di Ca 2 + di stampa nel caso di Ca 2 + scintille indotte in fibre FDB da stress osmotico, è meglio combinare le funzioni manuali e automatizzati di Ca 2 + innescare eventil&#39;identificazione e il trattamento con questi programmi di analisi di immagine personalizzata-build 11. Questo algoritmo è molto utile quando è necessario individuare manualmente il ROI (regione di interesse) in alcuni modelli di malattia muscolare. Una volta che il ROI è definito, l&#39;algoritmo potrebbe derivare automaticamente i parametri di accensione di cui sopra che potrebbero poi essere esportati in file Excel. In alternativa, il software di elaborazione delle immagini a disposizione del pubblico, ad esempio SparkMaster in ImageJ, può essere utilizzata per definire le proprietà cinetiche di Ca 2 + scintille e la loro distribuzione spaziale nel muscolo scheletrico 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Stutzmann, G. E., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+Ca2++handling+in+excitable+cells+in+health+and+disease.">Endoplasmic reticulum Ca2+ handling in excitable cells in health and disease.</a> Pharmacol. Rev. 63 (3), 700-727 (2011).</li><li>Cheng, H., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sparks.">Calcium sparks.</a> Physiol. Rev. 88 (4), 1491-1545 (2008).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+calcium+release+events+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+heart.">Elementary calcium release events from the sarcoplasmic reticulum in the heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 499-509 (2012).</li><li>Brochet, D. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quarky+calcium+release+in+the+heart.">Quarky calcium release in the heart.</a> Circ. Res. 108 (2), 210-218 (2011).</li><li>Guatimosim, S., Guatimosim, C., Song, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+sparks+in+cardiac+myocytes.">Imaging calcium sparks in cardiac myocytes.</a> Methods Mol. Biol. 689, 205-214 (2011).</li><li>Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-contraction+coupling+from+the+1950s+into+the+new+millennium.">Excitation-contraction coupling from the 1950s into the new millennium.</a> Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33 (9), 763-772 (2006).</li><li>Dulhunty, A. F., Casarotto, M. G., Beard, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ryanodine+receptor:+a+pivotal+Ca2++regulatory+protein+and+potential+therapeutic+drug+target.">The ryanodine receptor: a pivotal Ca2+ regulatory protein and potential therapeutic drug target.</a> Curr. Drug Targets. 12 (5), 709-723 (2011).</li><li>Kirsch, W. G., Uttenweiler, D., Fink, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spark-+and+ember-like+elementary+Ca2++release+events+in+skinned+fibres+of+adult+mammalian+skeletal+muscle.">Spark- and ember-like elementary Ca2+ release events in skinned fibres of adult mammalian skeletal muscle.</a> J. Physiol. 537, 379-389 (2001).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+probable+role+of+dihydropyridine+receptors+in+repression+of+Ca2++sparks+demonstrated+in+cultured+mammalian+muscle.">A probable role of dihydropyridine receptors in repression of Ca2+ sparks demonstrated in cultured mammalian muscle.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 290 (2), 539-553 (2006).</li><li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+and+embers+of+mammalian+muscle.">Ca2+ sparks and embers of mammalian muscle.</a> Properties of the sources. J. Gen. Physiol. 122 (1), 95-114 (2003).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncontrolled+calcium+sparks+act+as+a+dystrophic+signal+for+mammalian+skeletal+muscle.">Uncontrolled calcium sparks act as a dystrophic signal for mammalian skeletal muscle.</a> Nat. Cell. Biol. 7 (5), 525-530 (2005).</li><li>Teichmann, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+control+over+Ca2++sparks+via+mechanosensitive+channels+is+disrupted+in+dystrophin+deficient+muscle+but+restored+by+mini-dystrophin+expression.">Inhibitory control over Ca2+ sparks via mechanosensitive channels is disrupted in dystrophin deficient muscle but restored by mini-dystrophin expression.</a> PLoS One. 3 (11), e3644 (2008).</li><li>Shkryl, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+amplification+of+ROS+and+Ca2++signals+in+stressed+mdx+dystrophic+skeletal+muscle+fibers.">Reciprocal amplification of ROS and Ca2+ signals in stressed mdx dystrophic skeletal muscle fibers.</a> Pflugers. Arch. 458 (5), 915-928 (2009).</li><li>Lovering, R. M., Michaelson, L., Ward, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformed+mdx+myofibers+have+normal+cytoskeletal+architecture+yet+altered+EC+coupling+and+stress-induced+Ca2++signaling.">Malformed mdx myofibers have normal cytoskeletal architecture yet altered EC coupling and stress-induced Ca2+ signaling.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 297 (3), 571-580 (2009).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++sparks+as+a+plastic+signal+for+skeletal+muscle+health,+aging,+and+dystrophy.">Ca2+ sparks as a plastic signal for skeletal muscle health, aging, and dystrophy.</a> Acta. 27 (7), 791-798 (2006).</li><li>Weisleder, N., Zhou, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+calcium+sparks+in+intact+and+permeabilized+skeletal+muscle+fibers.">Detection of calcium sparks in intact and permeabilized skeletal muscle fibers.</a> Methods Mol. Biol. 798, 395-410 (2012).</li><li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SparkMaster:+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ.">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 293 (3), 1073-1081 (2007).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+aging+is+associated+with+compromised+Ca2++spark+signaling+and+segregated+intracellular+Ca2++release.">Muscle aging is associated with compromised Ca2+ spark signaling and segregated intracellular Ca2+ release.</a> J. Cell. Biol. 174 (5), 639-645 (2006).</li><li>Weisleder, N., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Ca2++sparks+in+aging+skeletal+and+cardiac+muscle.">Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle.</a> Ageing Res. Rev. 7 (3), 177-188 (2008).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake+regulates+rapid+calcium+transients+in+skeletal+muscle+during+excitation-contraction+(E-C)+coupling.">Mitochondrial calcium uptake regulates rapid calcium transients in skeletal muscle during excitation-contraction (E-C) coupling.</a> J. Biol. Chem. 286 (37), 32436-32443 (2011).</li><li>Tjondrokoesoemo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+(1,4,5)-trisphosphate+receptor+activates+ryanodine+receptor+1+to+mediate+calcium+spark+signaling+in+adult+Mammalian+skeletal+muscle.">Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 288, 2103-2109 (2013).</li><li>Martins, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+contribute+to+Ca2++signals+produced+by+osmotic+stress+in+mouse+skeletal+muscle+fibres.">Reactive oxygen species contribute to Ca2+ signals produced by osmotic stress in mouse skeletal muscle fibres.</a> J. Physiol. 586 (1), 197-210 (2008).</li><li>Apostol, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+calcium+signals+induced+by+hyper-osmotic+stress+in+mammalian+skeletal+muscle+cells.">Local calcium signals induced by hyper-osmotic stress in mammalian skeletal muscle cells.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 30 (3-4), 97-109 (2009).</li><li>Jiang, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate+(NAADP)+Activates+Global+and+Heterogeneous+Local+Ca2++Signals+from+NAADP-+and+Ryanodine+Receptor-gated+Ca2++Stores+in+Pulmonary+Arterial+myocytes.">Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate (NAADP) Activates Global and Heterogeneous Local Ca2+ Signals from NAADP- and Ryanodine Receptor-gated Ca2+ Stores in Pulmonary Arterial myocytes.</a> J. Biol. Chem. 288 (15), 10381-10394 (2013).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo di valutazione Ca 2 + scintille nel muscolo scheletrico intatto è un utile strumento per la fisiologia muscolare e ricerca di malattia. Abbiamo dimostrato che la risposta Ca 2 + scintilla è stato alterato in condizioni diverse, comprese distrofia muscolare 11, invecchiamento 18, 19, così come nella sclerosi laterale amiotrofica 20. Il nostro recente studio ha anche rivelato l&#39;accoppiamento funzionale tra IP 3 recettore e Ry...

Libero intracellulare Ca 2 + ([Ca 2 +] i) è un messaggero secondario versatile e importante che regola molteplici funzioni cellulari nelle cellule eccitabili come i neuroni, cardiaco, scheletrico e muscoli lisci (per recensione vedi Stutzmann e Mattson 1). Regolamentata Ca 2 + mobilitazione e di cross-talk tra reticolo sarcoplasmatico (SR) e T-tubulo (TT) membrane sono regolatori fondamentali della fisiologia muscolare. Inoltre, variazioni di Ca 2 + segnalazione avevano dimostrato di essere un meccanismo alla base della disfunzione contrattile in varie malattie muscolari. Ca 2 + scintille sono localizzati gli eventi Ca 2 + rilascio elementari provenienti dall&#39;apertura del recettore rianodina (RyR) del canale sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana 2. Nel muscolo cardiaco, scintille verificano spontaneamente attraverso l&#39;apertura del canale RyR2 da un Ca 2 +-indotti Ca 2 + release (CICR) Meccanismo di 3-5. Nel muscolo scheletrico, RyR1 è strettamente controllata dal sensore di tensione sulla membrana 6,7 TT. Così Ca 2 + scintille vengono soppressi e raramente rilevate in condizioni di riposo nelle fibre muscolari scheletriche intatte. Fino a poco tempo, la membrana sarcolemmal doveva essere disturbato da vari metodi chimici o meccanici &quot;skin&quot; per disaccoppiare la soppressione del sensore di tensione in RyR1 e ha permesso di Ca 2 + innescare eventi per essere rilevati nel muscolo scheletrico 8,9. Un metodo precedentemente descritto richiesto permeabilizzazione della membrana delle fibre muscolari dal detersivo saponina 10. Nel 2003, abbiamo scoperto che lo stress sia ipoosmotico transitori o stress iperosmotico potrebbero indurre periferico Ca 2 + scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte 11. Questo metodo è stato poi modificato per studiare il meccanismo molecolare e modulazione di Ca 2 + </sup&gt; rilascio e la dinamica 12-16. Qui delineare i dettagli del nostro approccio sperimentale per l&#39;induzione, il rilevamento e l&#39;analisi di Ca 2 + scintille nel muscolo scheletrico intatto. Presentiamo anche il programma di analisi scintilla su misura che può essere utilizzato per quantificare le proprietà elementari dei singoli Ca 2 + scintille nel muscolo scheletrico, ad esempio la frequenza di accensione e ampiezza (Δ F/F0, che riflette la probabilità di apertura dei canali RyR e il Ca 2 + carico all&#39;interno del SR); tempo al picco (tempo di salita) e durata (FDHM, piena durata ampiezza metà-massimale) di scintille, così come la distribuzione spaziale di Ca 2 + scintille. Inoltre, vi presentiamo la prova che pubblicitari alterato Ca 2 + scintille ai diversi stati fisiopatologici nel muscolo scheletrico, come la distrofia muscolare e la sclerosi laterale amiotrofica. Il vantaggio di questa tecnica comporta la capacità di misurare Ca 2 + in relativamente isolatori passanticellule invecchiate, invece di nudo le fibre muscolari, permettendo la registrazione di Ca 2 + scintille nelle condizioni più vicina alla fisiologica. Inoltre, il programma progettati su misura fornisce un calcolo più accurato delle proprietà della scintilla in relazione alle fibre muscolari.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="790">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Dissecting microscope</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:367px;">Dissect out fibers and check muscle integrity</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Dissection tools -scissors, and fine tip forceps</td>
			<td style="width:111px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW CORNING</td>
			<td style="width:119px;">184 SIL ELAST KIT</td>
			<td style="width:367px;">&#160;Make ahead of time for fiber dissection. Mix 5 ml liquid Sylgard components and pour into a 60-mm glass Petri dish and waiting 48 hr to let the Sylgard compound become clear, colorless solid substrate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60-mm glass petri dish&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Pyrex</td>
			<td style="width:119px;">3160</td>
			<td>Fiber dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Minimal Ca2+ Tyrode Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypotonic Tyrode Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">collagenase type I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-5138</td>
			<td>Fiber digestion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Fluo-4 AM&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Fluorescent Ca2+ imaging dyes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TMRE</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td>T669</td>
			<td>mitochondrial membrane potential fluorescent dyes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Delta TPG dishes&#160;</td>
			<td>Bioptechs</td>
			<td style="width:119px;">0420041500C</td>
			<td>35 mm glass bottom dish for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Spark Fit software</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Radiance 2100 laser scanning confocal microscope or equivalent microscope</td>
			<td style="width:111px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">3 axis micromanipulator</td>
			<td style="width:111px;">Narishige International</td>
			<td style="width:119px;">MHW-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">temperature controllable orbital shaker</td>
			<td style="width:111px;">New Brunswick scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fiber dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers

Il mantenimento omeostatico Ca 2 + segnalazione è un processo fisiologico fondamentale nelle cellule viventi. Ca 2 + scintille sono le unità elementari di Ca 2 + Segnalazione di fibre muscolari striate che appaiono come altamente localizzata Ca 2 + eventi di rilascio mediati dal recettore della rianodina (RyR) Ca 2 + rilascio canali sul reticolo sarcoplasmatico (SR) membrana. Corretta valutazione del muscolo Ca 2 + scintille potrebbero fornire informazioni sulle intracellulari di Ca 2 + proprietà manipolazione dei muscoli striati sani e malati. Sebbene Ca 2 + scintille eventi sono comunemente visto in cardiomiociti riposo, sono raramente osservati in riposo fibre muscolari scheletriche, quindi vi è la necessità di metodi per generare e analizzare scintille nelle fibre muscolari scheletriche. Dettagliate ecco un protocollo sperimentale per la misurazione Ca 2 + scintille in digitorm brevis (FDB) fibre muscolari isolate flessori con fluorescent Ca 2 + indictors e la microscopia confocale a scansione laser. In questo approccio, fibre FDB isolati sono esposti a stress ipoosmotico transitorio seguito da un ritorno di soluzione fisiologica isotonica. In queste condizioni, un robusto Ca 2 + scintille risposta viene rilevato adiacente alla membrana sarcolemmal in giovani fibre muscolari sani FDB. Alterato Ca 2 + scintille risposta viene rilevato in fibre muscolari scheletriche distrofici o invecchiate. Questo approccio ha recentemente dimostrato che la segnalazione membrana delimitato coinvolge cross-talk tra inositolo (1,4,5)-recettore trifosfato (IP 3 R) e RyR contribuisce a Ca 2 + attivazione scintilla nel muscolo scheletrico. In sintesi, i nostri studi con stress osmotico indotto Ca 2 + scintille hanno dimostrato che questa risposta intracellulare riflette un muscolo meccanismo di segnalazione in fisiologia e l&#39;invecchiamento / stati di malattia, compresi i modelli murini di distrofia muscolare (topi mdx) o la sclerosi laterale amiotrofica (ALS modello).

Studi precedenti hanno mostrato che lo stress ipoosmotico transitori indotti periferico Ca 2 + scintille adiacente alla membrana sarcolemmal nelle fibre muscolari intatte 11. Figura 1 mostra le immagini delle fibre muscolari intatte singole con membrana sarcolemmal liscia e caratteristiche striature chiare. Figura 2 è tipica Ca 2 + scintille (come immagini XY) sono stati indotti da (100 sec) trattamento transitorio con una soluzione ipoosmotico...

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Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca 2 + liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca 2 + liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca 2 + segnalazione possono essere utilizzati per valutare la funzione muscolare in salute e malattia.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  The Ohio State University Wexner Medical Center.  Qui descritto è un metodo per misurare direttamente scintille di calcio, le unità elementari di Ca 2 + liberano dal reticolo sarcoplasmatico in fibre muscolari scheletriche intatte. Questo metodo utilizza osmotico stress-mediata attivazione di Ca 2 + liberazione dal recettore della rianodina nelle fibre muscolari isolate. La dinamica e la capacità omeostatica di intracellulare di Ca 2 + segnalazione possono essere utilizzati per valuta...