Per iniziare la quantificazione delle metriche delle goccioline lipidiche IMAT colorate, aprire Confocal Stacks in ImageJ. Aprire l'interfaccia utente di Threshold selezionando Image, quindi Adjust (Regola), quindi Threshold (Soglia). Nell'interfaccia utente, selezionare Intermodalità come tipo di soglia e verificare che sia selezionata l'opzione Sfondo scuro.
Quindi fare clic su Applica per eseguire un algoritmo di soglia. Eseguire l'algoritmo del bacino idrografico per separare le goccioline lipidiche che si toccano selezionando Elabora, quindi Binario e Bacino idrografico. Selezionare Sì in una finestra di dialogo per elaborare tutte le immagini nella pila in modo da aggiungere una sottile linea nera che divide aree più grandi di bianco pieno.
Per impostare le dimensioni massime e minime delle particelle, aprite l'immagine originale e delineate la gocciolina lipidica più piccola e più grande in vista utilizzando lo strumento Ovale. Quindi aggiungi queste forme a ROI Manager digitando T.Select Analizza, quindi Imposta misurazioni. Nella finestra di dialogo, selezionare le impostazioni, selezionare Solo area e fare clic su OK. Quindi seleziona Misura da Gestione ROI.
Utilizzare le due misure di area di questa finestra dei risultati come intervallo di dimensioni e analizzare le particelle. Identificare la regione di interesse, o ROI, con l'algoritmo di analisi delle particelle. Selezionare Analizza, quindi Analizza particelle.
Viene visualizzata una finestra di dialogo per impostare le impostazioni di selezione. Per generare le misurazioni del ROI, selezionare Analizza, quindi Imposta misurazioni e selezionare Area, Centroide, Adatta ellisse e Posizione pila. Fare clic su OK. Quindi seleziona Misura da Gestione ROI.
I dati nella tabella dei risultati possono essere selezionati e copiati in Excel per ulteriori analisi. Per una valutazione dettagliata delle metriche e della distribuzione delle singole goccioline lipidiche, le goccioline lipidiche marcate con fluorescenza BODIPY sono state sottoposte a imaging tramite microscopia confocale. La soglia e la segmentazione della forma hanno fornito un buon primo passaggio per generare ROI per ogni goccia lipidica.
Tuttavia, sono state necessarie modifiche manuali per correggere gli errori. Le goccioline lipidiche profonde, che apparivano deboli sull'immagine, possono essere aggiunte manualmente utilizzando lo strumento Ovale in ImageJ. Un gruppo di goccioline lipidiche erroneamente identificate come una singola ROI può anche essere corretto eliminando e sostituendo la ROI originale con più nuove ROI.
Laddove una singola gocciolina lipidica è stata identificata come un ROI unico in più fette, le ROI duplicate sono state consolidate in un'unica ROI.
