Aprire il software LightBox per l'acquisizione delle immagini. Per selezionare i set di laser e filtri, utilizzare i parametri per un colorante arancione selezionando il colorante utilizzato nella colorazione dall'elenco dei coloranti. Utilizzando una panoramica, fai clic su live per mettere a fuoco le celle.
Una volta che le celle sono a fuoco, regolare le impostazioni di acquisizione confocale. Successivamente, seleziona il pulsante ROI rettangolare e crea una regione di interesse attorno a un mitocondri di interesse facendo clic e trascinando per modellare la regione. Per regolare il gating del rivelatore per l'esaurimento dell'emissione stimolata o l'acquisizione costante, accanto al menu generale, selezionare il menu gating o fare clic e tenere premuto per aggiungere il menu alla vista.
Per l'acquisizione costante, impostare il laser di eccitazione dal 15 al 20% e il laser di esaurimento costante dal 20 al 25% con 10 accumuli di linee. Utilizzare un tempo di permanenza dei pixel di quattro microsecondi e una dimensione dei pixel compresa tra 20 e 25 nanometri. Esegui il time lapse selezionando il menu a discesa del tempo, quindi impostando il numero di iterazioni su cinque e un intervallo di tempo di 25 o 30 secondi.
È possibile eseguire uno Z-stack utilizzando l'opzione del volume e regolando l'intervallo di volume Z desiderato e la dimensione del passo. Apri il software di deconvoluzione delle immagini stead per decontorcere le immagini stead grezze con l'algoritmo software. Dopo essersi assicurati che i parametri microscopici siano corretti, selezionare il pulsante rapido e impostare il tipo di deconvoluzione su Veloce, Standard, Aggressivo o Conservativo per vari gradi di potenza di deconvoluzione.
Eseguire la deconvoluzione. Salvare le immagini in formato ICS2. Nell'immagine J, fare clic su file, quindi aprire per aprire i file ICS2 dal software di deconvoluzione.
Seleziona i plug-in, quindi la segmentazione seguita dalla segmentazione Weka addestrabile per aprire le immagini stead decontorte nel plug-in di segmentazione Weka addestrabile. Nelle impostazioni di segmentazione, selezionare le funzioni di sfocatura gaussiana, proiezioni di membrana e filtro sobel. Etichetta una classe come cristae e l'altra come sfondo.
Successivamente, traccia una linea sulla struttura da assegnare a una delle classi. Quindi seleziona il pulsante Aggiungi sul lato destro per cristae o sfondo. Quindi seleziona il pulsante del classificatore del treno sul lato sinistro per generare una mappa in base alle informazioni fornite al plug-in.
Fare clic sul pulsante Salva classificatore per salvare le impostazioni del classificatore per la segmentazione futura. Usa la mappa di probabilità cristae per sogliare l'immagine nell'immagine J per generare una maschera binaria, quindi vai ad analizzare, quindi analizza le particelle. Infine, disegna una linea a più punti, regola lo spessore della linea a diversi pixel di larghezza e scanalatura della linea per adattarla ai mitocondri.
In questo studio, l'imaging dei mitocondri in cellule SH-SY5Y differenziate con acido retinoico indifferenziato con imaging time-lapse come mostrato. Le immagini stead deconvolute possono essere utilizzate per determinare la periodicità delle cristae in una data area e le misure di dimensioni e forma delle cristae.
