Questo metodo consente di indagare su come lo stato redox mitocondriale è influenzato in condizioni fisiopatologiche. Può anche essere utilizzato per valutare l'efficacia delle strategie di trattamento che mirano a proteggere i mitocondri. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una valutazione organica e specifica dei cambiamenti dinamici e di tracciamento sullo stato redox dei mitocondri in tempo reale.
Questo metodo può essere combinato con indicatori aggiuntivi per registrare simultaneamente, ad esempio, il potenziale di membrana mitocondriale o le concentrazioni di calcio oltre allo stato redox. Questo protocollo può essere applicato a cellule di coltura, espianti tissutali e colture di fette. Inizia ottimizzando le impostazioni del microscopio confocale a scansione.
Per fare ciò, impostare il rilevatore a 12 bit o 16 bit, attivare la modalità di scansione sequenziale e aggiungere una seconda sequenza / traccia. Per entrambi i canali, selezionare una tabella di ricerca a pseudo colori che indichi i pixel sovra e sottoesposti, quindi selezionare un obiettivo adatto all'oggetto di interesse. Montare un coverslip con le cellule nella camera di imaging.
Aggiungere un millilitro di tampone di imaging e posizionare la camera sul microscopio. Utilizzare l'oculare e la luce trasmessa per mettere a fuoco le cellule. Registra immagini con diversi formati di pixel e dimensioni stenopeiche.
Quindi registrare immagini con diverse intensità laser e di conseguenza regolare il guadagno e la soglia del rilevatore. Infine, registra immagini con diverse velocità di scansione e diversi numeri di medie dei fotogrammi. Per l'imaging dal vivo, impostare l'intervallo di timelapse su 30 secondi e la durata su 25 minuti.
Quindi montare le cellule, posizionare la camera sul microscopio e focalizzare le cellule come dimostrato in precedenza. Passare alla modalità di scansione e utilizzare il canale a 488 nanometri nella vista dal vivo per mettere a fuoco e individuare le celle per l'imaging. Facoltativamente, per aumentare il numero di celle registrate per esecuzione, utilizzare la funzione multipunto per visualizzare due o tre campi visivi per copertina.
Avviare l'acquisizione del timelapse e registrare cinque immagini come registrazione di base di due minuti. Aggiungere 500 microlitri di soluzione NMDA 3X alla camera per raggiungere la concentrazione finale di 30 micromolari e registrare ulteriori 20 immagini come risposta NMDA di 10 minuti. Quindi, aggiungere 500 microlitri di soluzione 4X DA alla camera e registrare altre sei immagini.
Aspirare il tampone dalla camera di imaging e sostituirlo con un millilitro di soluzione DTT. Dopo aver registrato altre 10 immagini, terminare la registrazione e salvare la serie di immagini. Per importare i dati nel software di analisi delle immagini, fare clic su plug-in, selezionare i formati bio e quindi l'importatore di formati bio.
Nella finestra di dialogo, scegliete hyperstack nello stack di viste con, impostate la modalità colore come predefinita e selezionate ridimensionamento automatico. Modificare il formato dell'immagine a 32 bit facendo clic sull'immagine, selezionando tipo, quindi dalle opzioni scegliere 32 bit. Per dividere i canali di colore in finestre separate, fare clic sull'immagine, andare a colorare e selezionare i canali divisi.
Regolare la soglia per selezionare i mitocondri per l'analisi facendo clic sull'immagine, selezionando regola e soglia. Nella finestra di dialogo, selezionare lo sfondo scuro rosso predefinito e l'istogramma della pila. Quando i pixel selezionati appaiono rossi, fare clic su Applica.
Quindi selezionare Imposta pixel di sfondo su NAN elaborare tutte le immagini ed eseguire la stessa procedura per il canale due. Per visualizzare il rapporto da 405 a 488 nanometri, creare un'immagine di rapporto facendo clic su processo e calcolatrice di immagini. Nella finestra di dialogo, selezionare il canale uno nell'immagine uno dividere nel canale operativo due nell'immagine due.
Quindi selezionare Crea nuova finestra ed elaborare tutte le immagini. Modificare la tabella di ricerca del rapporto immagine in pseudo colore facendo clic sull'immagine, selezionando tabelle di ricerca e quindi attivare. Per analizzare l'immagine, disegnare ROI attorno a singole cellule o mitocondri sull'immagine del rapporto.
Per aggiungere i ROI a ROI manager, vai ad analizzare, fai clic sugli strumenti, seleziona ROI manager, fai clic su aggiungi e seleziona mostra tutto. Per misurare i rapporti da 405 a 488 nanometri delle singole celle, fare clic su ROI manager, selezionare tutti i ROI premendo Ctrl A, andare su altro e selezionare multi-misura. Nella finestra di dialogo, selezionate Misura tutte le sezioni e una riga per sezione.
Dopo aver esportato le misurazioni nel software del foglio di calcolo, selezionare l'immagine a 405 nanometri, misurare le intensità di tutti i ROI ed esportare nuovamente le misurazioni nel software del foglio di calcolo. Allo stesso modo, misurare le intensità roi dell'immagine a 488 nanometri. Per salvare i ROI per riferimento futuro, selezionare tutti i ROI premendo Ctrl A, andare su altro e selezionare Salva.
Queste istantanee rappresentative da una registrazione timelapse mostrano immagini di rapporto dei neuroni prima e dopo il trattamento NMDA e dopo la calibrazione max / min con DA e DTT. Il trattamento dei neuroni con 30 NMDA micromolari ha indotto l'ossidazione dei mitocondri in pochi minuti. L'analisi dei singoli canali di fluorescenza ha rivelato che l'acidosi mitocondriale indotta da NMDA ha causato una caduta della fluorescenza GFP sia all'eccitazione di 405 che a 488 nanometri.
In un esperimento di controllo, il pretrattamento con DA ha precluso qualsiasi ulteriore ossidazione dei mitocondri da parte di NMDA. E di conseguenza, il rapporto 405 a 488 non è cambiato nonostante una notevole tempra dell'intensità di fluorescenza GFP2 redox-sensibile. Questo esperimento ha confermato che il rapporto tra 405 e 488 nanometri non è influenzato dai cambiamenti di pH.
In un esperimento separato, il potenziale di membrana mitocondriale, lo stato redox e la morfologia sono stati valutati in parallelo. Il trattamento dei neuroni con NMDA 60 micromolari ha provocato la perdita del segnale tetrametilrodramina o TMRE e un aumento del rapporto rho GFP da 405 a 488 nanometri seguito da un arrotondamento ritardato dei mitocondri. Quando si inizia a utilizzare questo metodo, è molto importante dedicare del tempo per ottimizzare attentamente le impostazioni microscopiche.
Questo aiuterà a mantenere i neuroni sani durante i tuoi esperimenti. È anche molto importante rispettare sempre le regole di sicurezza laser. Assicurati di non essere esposto alle radiazioni laser quando aggiungi farmaci da manomettere durante le registrazioni dal vivo.
