Questa tecnica può essere utilizzata per far progredire la nostra comprensione della gestione del calcio nei neuroni e di come il calcio compartimentato può regolare diversi meccanismi importanti per la funzione neuronale in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente una maggiore risoluzione rapida in vivo di imaging in condizioni fisiologiche in C.elegans che possono essere combinati con altri strumenti fluorescenti. Questa tecnica potrebbe fornire informazioni sul meccanismo che regola la segnalazione del calcio nei neuroni in molti contesti diversi.
Ad esempio, durante l'invecchiamento, lesioni neuronali e neurodegenerazione. A dimostrare questa procedura sarà Ennis Deihl, tecnico di ricerca. Kaz Knight, dottorando, e Rachel Doser, ricercatrice post-dottorato del mio laboratorio.
Inizia clonando vettori di espressione che contengono un promotore seguito da un indicatore di calcio e tre UTR principali di scelta. Creare ceppi transgenici di C.elegans mediante microiniezione di una miscela di DNA contenente il DNA di salvataggio Lin-15 plus nel transgene indicatore di calcio nella gonade di un adulto di un giorno di C.elegans. Mantenere i vermi genitori iniettati a 20 gradi Celsius fino a quando la progenie F1 raggiunge l'età adulta.
Selezionare adulti transgenici mediante screening per l'assenza del fenotipo multi-vulva. Ciò indica l'espressione dell'array cromosomico extra contenente l'indicatore di calcio. Progenie F1 adulta di passaggio clonale che non ha il fenotipo multi-vulva.
Eseguire esperimenti sulle generazioni successive dei ceppi transgenici con un'espressione ottimale dell'indicatore di calcio. Utilizzare un microscopio in grado di imaging Time-lapse a lungo termine. Individuare il worm sotto un obiettivo a basso ingrandimento e quindi passare a un obiettivo ad alto ingrandimento per localizzare i neuroni.
Acquisisci le immagini utilizzando una fotocamera ultrasensibile in grado di acquisire rapidamente le immagini a più di 50 FPS. Quindi, utilizzare un filtro di emissione standard per l'indicatore di calcio. Aggiungi un correttore Z-drift per l'acquisizione di flussi di immagini più lunghi di 10 secondi.
In un tubo di coltura di vetro da 13 x 100 millimetri preparare tre millilitri di agar al 10% sciogliendo l'agar di grado molecolare in M9 e microonde per diversi secondi. Per realizzare i cuscinetti di agar, in primo luogo, preparare due vetrini aggiungendo due strati di nastro da laboratorio. Quindi posizionare un vetrino da microscopio tra i due vetrini.
Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1000 microlitri e utilizzarla per pipettare una piccola goccia di agar al centro della slitta del coperchio. Appiattire l'agar premendo un'altra diapositiva verso il basso sopra l'agar. Dopo il raffreddamento, tagliare l'agar in un piccolo disco usando l'apertura di un tubo da 10 millilitri, quindi rimuovere l'agar circostante.
Quindi, preparare la soluzione di laminazione della vite senza fine sciogliendo la polvere di muscimolo in M9 per creare uno stock di 30 millimolari. Diluire il brodo in un rapporto uno a uno con perle di polistirolo per ottenere la soluzione di laminazione. Per posizionare il verme per l'imaging, in primo luogo, posizionare 1,6 microlitri della soluzione di laminazione al centro del pad di agar.
Quindi, utilizzando un plettro per vite senza fine preferito, trasferire un verme dell'età desiderata nella soluzione di laminazione sul pad di agar. Attendere circa cinque minuti affinché il muscimolo riduca il movimento del verme, quindi rilasciare una scivolata di copertura di 22 x 22 millimetri sulla parte superiore del cuscinetto di agar. Per l'imaging dei neuriti nel cordone nervoso ventrale, arrotolare il verme facendo scorrere leggermente la linguetta di copertura.
Per montare il verme sul microscopio, posizionare una goccia di olio ad immersione sul vetrino di copertura. Trova il worm usando un obiettivo a basso ingrandimento in campo chiaro. Quindi passare all'obiettivo 100x e localizzare il neurite AVA utilizzando l'illuminazione del GCaMP o mito GCaMP con il laser di imaging a 488 nanometri.
Per l'imaging GCaMP in vivo, regolare il laser di imaging nelle impostazioni di acquisizione fino a quando la fluorescenza GCaMP del basilico è nella gamma media della gamma dinamica della fotocamera e impostare il tempo di esposizione su 20 millisecondi. Dopo aver localizzato il neurite AVA utilizzando la fluorescenza GCaMP a 100 volte l'ingrandimento, impostare il correttore Z-drift e avviare la messa a fuoco automatica continua. Correggere manualmente il piano focale in base alle esigenze prima di eseguire l'imaging.
Acquisisci un flusso di immagini con un ingrandimento di 100 volte. Utilizzando questo protocollo, il calcio citoplasmatico è stato misurato con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. L'espressione cellulare specifica di GCaMP6F negli interneuroni di comando glutammatergici AVA ha rivelato una propagazione direzionale dell'afflusso di calcio.
La quantificazione subcellulare della fluorescenza GCaMP6F ha mostrato che l'insorgenza dell'afflusso di calcio era ritardata in una porzione del neurite situata a soli 10 micrometri di distanza. Inoltre, le strutture dendritiche simili a spine trovate lungo il neurite AVA hanno mostrato lampi nella fluorescenza GCaMP6F che si sono verificati indipendentemente dall'attivazione dei neuriti e non hanno portato a una propagazione dell'afflusso di calcio. Inoltre, i livelli relativi di calcio sono stati misurati nei singoli mitocondri in singoli neuriti utilizzando un ceppo di verme con un'espressione specifica AVA dell'indicatore di calcio localizzato della matrice mitocondriale mito GCaMP.
I risultati hanno mostrato l'assorbimento sincrono di una quantità relativamente grande di calcio in un sottogruppo di mitocondri. In particolare, l'assorbimento del calcio in alcuni mitocondri era sincronizzato, mentre i mitocondri vicini non sembravano assorbire calcio. Allo stesso modo, sottogruppi di mitocondri hanno mostrato un rapido assorbimento e rilascio di piccole quantità di calcio.
Anche questo sembrava essere sincrono, ma solo per un sottoinsieme di mitocondri. La velocità e le manipolazioni fini sono essenziali per posizionare gli animali e mantenere la funzione neuronale. Anche la salute degli animali è fondamentale.
Anche un po 'di fame è problematico. La parte più difficile da imparare è il rapido orientamento degli animali per la microscopia confocale senza danni. Il mio consiglio è molta pratica e buoni controlli.
Questo protocollo potrebbe essere applicato a esperimenti in cui il calcio viene rilasciato da altre posizioni subcellulari nei neuroni, altri neuroni o cellule diverse dai neuroni in C.elegans. Poiché questo approccio in C.elegans lascia intatti gli animali, è possibile affrontare domande sulla regolazione della gestione subcellulare del calcio in vivo in singoli neuroni di un sistema nervoso completo.
