Utilizzando un microscopio confocale e un obiettivo 40X, creare un profilo di scansione con i canali fluorescenti appropriati per il marcatore lipidico utilizzato. Dopo aver impostato la modalità di acquisizione e i canali, ottimizzare la strategia di messa a fuoco facendo clic su Messa a fuoco automatica software. Quindi impostare l'intervallo dello stack Z su 20 micron.
Successivamente, ottimizza i riquadri e apri il visualizzatore per selezionare le posizioni dei riquadri. Successivamente, utilizzando un metodo di elaborazione batch delle immagini, creare proiezioni massime di ogni Z Stack con il metodo della profondità di messa a fuoco estesa. Prima di esportare le immagini, impostare la compressione su nessuna e assicurarsi che i dati originali siano selezionati.
L'immagine risultante è una scala di grigi TIFF di massima proiezione del solo canale di fluorescenza, che esprime il marcatore lipidico. Identifica le immagini TIFF che rappresentano Nile Red, BODIPY o APOE e spostale nella cartella Images all'interno di una directory denominata Nile Red, BODIPY o APOE, a seconda del metodo utilizzato. Aprire il software dell'unità lipidica.
Nella scheda Stima selezionare la directory pertinente facendo clic sui puntini di sospensione e passando alla directory denominata. Verificare che l'unità lipidica abbia identificato correttamente le immagini controllando la voce della classe. Fare clic su Prevedi per osservare l'avanzamento dell'attività, quindi, utilizzando lo strumento Analisi maschera, scorrere le maschere generate e fornire un conteggio quantitativo dei depositi lipidici di soglia dalle immagini della maschera.
Il successo della differenziazione e della maturazione dell'RPE ha mostrato un monostrato confluente con pigmentazione e morfologia poligonale. Al contrario, la differenziazione infruttuosa ha mostrato gruppi di cellule morenti. Nelle immagini fluorescenti, i depositi di Nile Red e BODIPY apparivano come piccoli punti circolari luminosi.
Un risultato negativo mostra una segmentazione errata dell'immagine scambiando la fluorescenza di fondo come un deposito, a causa di una debole colorazione o di un'elevata intensità di fondo. Vengono mostrati depositi di APOE che variano per dimensioni, forma e intensità del segnale e che richiedono l'ottimizzazione dei metodi di colorazione e imaging per ridurre al minimo le variazioni.
