I disturbi correlati all'RPE rimangono una parte importante della miscelazione delle malattie, ma senza resti efficaci nella coltura virtuale di cellule RPE primarie che servano da buon modello per studi fisiologici e patologici sui disturbi correlati all'RPE. In questo protocollo, forniamo un protocollo facile da seguire per la coltura di IPC primari, che potrebbe rapidamente ripristinare e mantenere le caratteristiche RP successive, crediamo che utilizzando questo metodo le persone potrebbero generare rapidamente cellule RP da studi di macistate e screening di farmaci protettivi che potrebbero facilitare lo sviluppo di nuovi trattamenti per i disturbi RPE. Una dimostrazione del valore passo dopo passo renderà questo metodo molto più facile da replicare in diversi laboratori che vogliono studiare le cellule RP.
Per iniziare a scongelare l'enzima di digestione tissutale malaquad e sterilizzare 1X PBS. Integrato con 2% di penicillina e 2% di streptomicina filtrando la soluzione attraverso un'unità filtrante a siringa da 0,22 micrometri. Lavare i pozzetti della piastra di coltura e gli inserti transwell con 1X PBS.
Rimuovere il PBS dai pozzetti e dai transwell con una pipetta e aggiungere un millilitro di PBS 1X fresco alla camera inferiore e 600 microlitri di soluzione di Laminin da 10 microgrammi per millilitro alla camera superiore. Incubare le piastre e gli inserti transwell in questo incubatore di elicicoltura durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, rimuovere la soluzione laminata dalla camera superiore e lavare con un millilitro di PBS freddo 1X due volte prima di posizionare la cella Pulire la cappa di flusso in laminato con etanolo al 75% e luce UV.
Preparare tre provette da centrifuga sterili da 50 millilitri contenenti circa 25 millilitri di etanolo al 75%, tre provette da centrifuga sterili da 50 millilitri contenenti circa 25 millilitri di 1X PBS e tre piastre di coltura cellulare sterile da 10 centimetri contenenti circa 15 millilitri di 1X PBS. Immergere quattro bulbi oculari suini in circa 15 millilitri di etanolo al 75% in una capsula di Petri di 10 centimetri e utilizzare un paio di forbici e pinze per tagliare tutti i tessuti connettivi e i muscoli residui. Per decontaminare i bulbi oculari, immergere e lavare quattro bulbi oculari in tre provette centrifughe sterili da 50 millilitri riempite con etanolo al 75% in sequenza.
Quindi lavare i bulbi oculari in tre provette centrifughe sterili da 50 millilitri riempite con 1X PBS in sequenza. Capovolgere i tubi ogni minuto per lavare accuratamente i bulbi oculari. Spostare i quattro bulbi oculari in un piatto di coltura cellulare sterile di 10 centimetri contenente 1X PBS.
Tagliare nuovamente la superficie esterna di ciascun bulbo oculare, per rimuovere il nervo ottico e piccoli detriti. Usa le forbici per fare un piccolo taglio all'incrocio tra limbus e sclera. E poi rimuovere la cornea, l'iride, il cristallino, il corpo vitreo e la retina neurale.
Trasferire il complesso di sclera della coroide RPE in un nuovo piatto di coltura cellulare di 10 centimetri ed effettuare quattro tagli per appiattire la coppa oculare a forma di quadrifoglio. Eseguire viaggi nella digestione della soluzione EDTA posizionando i quattro complessi di sclera coroidea RPE in un nuovo piatto di 10 centimetri e versando 20 millilitri di soluzione EDTA di tripsina fresca per unire i complessi di sclera coroidea RPE. Posizionare il piatto nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius per quasi 30 minuti.
Dopo 30 minuti, estrarre il piatto dall'incubatore e aggiungere 20 millilitri di terreno di coltura cellulare pre-caldo con il 10% di FBS al piatto. Per neutralizzare i viaggi in soluzione EDTA utilizzare una pipetta di trasferimento da cinque millilitri per dissociare le celle RPE pipettando delicatamente più volte. Raccogliere le sospensioni cellulari in provette da centrifuga da 15 millilitri, quindi pipettare delicatamente altri 10 millilitri di terreno di coltura fresco con FBS per lavare i complessi di sclera RPE Choroids sul piatto.
Raccogliere le celle RPE centrifugando i tubi a 300 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il SuperAgent usando una pipetta e aggiungere altri cinque millilitri di terreno di coltura con FBS per risospendere le cellule. Centrifugare a 300 g per altri cinque minuti.
Decantare il SuperAgent e risospendere le cellule con 12 millilitri di terreno di coltura. Successivamente seme da 100.000 a 200.000 cellule per pozzetto in 12 piastre di coltura Well o inserti transwell. Cambiare i terreni di coltura ogni due giorni e ridurre la concentrazione sierica all'1% quando le cellule coprono completamente la superficie dei pozzetti per inserto.
Cambiare i terreni di coltura ogni due giorni fino a quando le cellule non vengono raccolte. Le immagini rappresentative delle cellule RPE primarie suine il giorno due, il sesto giorno e il giorno 10 sono mostrate qui. L'analisi QRTPCR dei livelli di mRNA dei geni firma nelle cellule RPE primarie suine, nelle cellule RPE umane primarie, nelle cellule ARPE 19 e nel tessuto coroideo RPE suino viene rilevata da questa immagine grafica.
Qui GAP DH è stato usato come gene di pulizia per RTPCR. Quattro repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule RPE primarie suine e una RPE 19 cellule in cui tre repliche biologiche sono state utilizzate per le cellule RPE umane primarie e il tessuto coroideo RPE suino. I livelli di espressione genica nelle cellule ARPE 19 sono stati impostati come controlli.
In questa figura sono mostrate le analisi del sangue occidentale delle proteine RPE 65 nelle cellule ARPE 19 e RPE suine e nelle cellule RPE umane primarie e nei tessuti coroidei RPE suini. Vinculin è stato utilizzato qui come controllo del carico. Questa figura mostra una coltura di due settimane di cellule RPE suine in terreni DMEM Basic con 1% FBS.
Le cellule coltivate con o senza Lamin sono state colorate con RPE 65, APTA di sodio e potassio, Z01 e Hex. Le misurazioni TR in fogli cellulari, coltivati con o senza laminina sono rappresentate in questa figura. L'analisi del sangue occidentale del fattore di crescita endoteliale vascolare o VEGF e del fattore derivato dall'epitelio pigmentato o PEDF nelle cellule RPE e ARPE 19 primarie suine sono mostrate in questa figura.
Le funzioni settoriali delle cellule RPE e ARPE 19 primarie suine coltivate sono presentate in queste immagini. La maggior parte di questo protocollo è quello di dissolvere le cellule RP dai complessi gliali chide RPE. Si consiglia di utilizzare ogni volta viaggi e soluzioni freschi e il corretto controllo del tempo di digestione, per sciogliere otto cellule RP.
