Il pesce zebra è unico nella sua capacità intrinseca di rigenerare molti tipi di tessuto diversi, incluso l'RPE. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare i percorsi molecolari che guidano la rigenerazione RPE e i meccanismi correlati alla malattia RPE. La versatilità è un vantaggio primario di questa metodologia.
Oltre a studiare la rigenerazione RPE, questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i processi degenerativi RPE e gli effetti del danno RPE sui tessuti adiacenti nell'occhio. I mammiferi, compresi gli esseri umani, non sono in grado di riparare grandi lesioni DA RPE derivanti da traumi o malattie degenerative. L'utilizzo del pesce zebra come strumento per scoprire i fattori pro-rigenerativi RPE è un passo significativo verso la promozione della rigenerazione RPE nei mammiferi.
Per preparare una soluzione MTZ fresca da 10 millimolari, cinque giorni dopo la concimazione, aggiungere la polvere MTZ all'acqua di sistema senza PTU e mescolare accuratamente agitando vigorosamente per un'ora a 37 gradi Celsius. Raffreddare la soluzione MTZ da 10 millimolari per un'ora a temperatura ambiente su un rotatore o uno shaker da tavolo. Per lo screening delle larve di zebrafish dal transgene rpe65a:nsfB-eGFP, separare le larve transgeniche eGFP positive dalle larve negative eGFP non transgeniche utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente con un laser di eccitazione a 488 nanometri.
Wake le larve schermate immediatamente pipettando direttamente in una capsula di Petri con PTU fresco 1,5X senza tricaina. Al termine dello screening, separare ulteriormente le larve positive all'eGFP in due gruppi di piastre di Petri, un gruppo per ricevere il trattamento MTZ e un gruppo per essere il controllo non pubblicato. Quindi ablare l'epitelio pigmentato retinico rimuovendo 1,5X PTU dai piatti di trattamento ablati e aggiungere la soluzione MTZ da 10 millimolari appena prodotta.
Rimuovere anche 1,5X PTU dalle piastre di controllo non blopedi e aggiungere acqua fresca di sistema senza PTU. Rimuovere la soluzione MTZ da 10 millimolari dopo esattamente 24 ore e aggiungere acqua di sistema fresca senza PTU. Cambiare l'acqua fresca del sistema senza PTU sui piatti negativi MTZ.
Schermo eGFP larve positive a quattro giorni dopo la fecondazione. L'eGFP è visibile quattro giorni dopo la fecondazione, ma appare più debole dell'intensità del segnale il quinto giorno. Posizionare le larve positive all'eGFP in piastre a sei pozzetti invece di piastre di Petri a una densità non superiore a 10 larve per pozzetto per il trattamento farmacologico.
Designare piastre separate a sei pozzetti per larve ablate e non ablate. Determinare il volume di 15 micromolari IWR-1 o il volume corrispondente ai pre-trattamenti di controllo del veicolo DMSO necessari e aliquota 1,5X PTU in tubi conici di conseguenza. Aggiungere lo stock IWR-1 a 1,5X PTU per una concentrazione finale di 15 micromolari IWR-1.
Aggiungi un volume corrispondente di azioni DMSO a 1,5X PTU. Mescolare bene vorticando e confermare visivamente la dissoluzione dei composti. Rimuovere 1,5X PTU dalle larve positive eGFP in piastre a sei pozzetti e aggiungere cinque millilitri per pozzetto di 0,06% DMSO appena fatto o 15 micromolari IWR-1 trattamenti.
Ablate l'RPE il giorno successivo. Nei cinque giorni successivi alla fecondazione, determinare il volume dei trattamenti farmacologici e di controllo del veicolo necessari per piastre a sei pozzetti non ablate e ablate e volumi appropriati di aliquota di acqua di sistema dolce senza PTU o soluzione MTZ da 10 millimolari in tubi conici. Aggiungere le soluzioni di riserva IWR-1 e DMSO ai rispettivi tubi conici come eseguito in precedenza.
Mescolare bene vorticando e confermare visivamente la dissoluzione dei composti. Rimuovere lo 0,06% di DMSO e 15 pre-trattamenti micromolari IWR-1 in 1,5X PTU da piastre a sei pozzetti designate non ablate e ablate. Reintegrare con l'acqua di sistema dolce appropriata senza trattamenti di soluzione PTU e MTZ.
Rimuovere lo 0,06% di DMSO e 15 trattamenti micromolari IWR-1 in soluzione MTZ da 10 millimolari dopo esattamente 24 ore e reintegrare con trattamenti in acqua dolce di sistema senza PTU. Ricostituire lo 0,06% di DMSO e 15 trattamenti IWR-1 micromolari in acqua dolce di sistema senza PTU sulla piastra a sei pozzetti nonblata. Monitorare il successo e l'estensione dell'ablazione in vivo utilizzando l'illuminazione a luce trasmessa su uno stereomicroscopio per il mantenimento larvale post-ablazione genetica.
Per generare la regione di interesse RPE o ROI utilizzando Fiji, apri un'immagine TIFF a otto bit, riorienta l'immagine in modo che il lato dorsale sia rivolto verso l'alto e il distale sia lasciato scegliendo l'immagine, trasformando e capovolgendo orizzontalmente. Per l'ultimo comando, scegli l'opzione più adatta alla direzionalità necessaria per quell'immagine. Avvia il ROI manager scegliendo analisi, strumenti, ROI manager.
Usa l'immagine, lo zoom e passa tra i canali DAPI e Brightfield. Usa le scorciatoie da tastiera per l'efficienza. Identificare il punto in cui il lato apicale dell'RPE è adiacente dalla punta della membrana limitante esterna e utilizzare questo punto di riferimento anatomico come punto di partenza del ROI.
Crea il ROI RPE con lo strumento di selezione dei poligoni nella barra degli strumenti Fiji utilizzando entrambi i canali di immagine DAPI e Brightfield e la funzione di zoom dell'immagine per identificare i limiti RPE apicali e basali. Porta le estremità dorsali e ventrali del ROI a un punto acuto piuttosto che smussare o arrotondare. Aggiungi il ROI facendo clic su Aggiungi nel ROI manager.
Salva il file ROI scegliendo di più e salva all'interno del ROI manager. Fare doppio clic sul rpegen. m da aprire nel riquadro dell'editor.
Sotto la sezione variabile definita dall'utente del rpegen. m file, inserisci i percorsi della directory per le cartelle contenenti i file roi, i file di immagine tiff e dove devono essere salvati i file di output. Immettere il nome del gruppo per il file mat da esportare e la posizione del canale Brightfield nello stack di immagini TIFF.
Esegui lo script facendo clic sul pulsante Esegui nel menu dell'editor nella parte superiore di MATLAB. Dopo aver salvato il file MAT, verrà visualizzata una figura a tre pannelli che verrà salvata anche come PDF nella directory di output per ogni esecuzione dell'immagine. Attendere che questi PDF di controllo qualità siano stati salvati nella cartella di output e l'ultima figura sia scomparsa.
Aprire i singoli PDF e verificare che tutti i ROI corrispondano alle immagini Brightfield. Fare doppio clic sul rpegen_permplot. m da aprire in una nuova scheda dell'editor.
Nella sezione Variabili definite da un utente, immettere il percorso della directory per la cartella di output contenente i file MAT dall'esecuzione di rpegen. m script. Immettere ogni nome file MAT da caricare.
Eseguire questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu dell'editor. Nella seconda sezione, inserire i nomi dei due gruppi per un confronto statistico nei dati A e nei dati B variabili e designare il numero di ripetizioni di simulazione di permutazione nella variabile reps. Solo 2.000 ripetizioni sono state utilizzate per questa demo per ridurre i tempi di elaborazione.
Eseguire questa sezione dello script facendo clic sul pulsante Esegui sezione nel menu dell'editor. Esegui la figura della mappa di calore e raggruppa i risultati e le sezioni del valore P in modo indipendente utilizzando il pulsante Esegui sezione. Il danno dell'intero monte di una larva post-fecondazione di cinque giorni ha mostrato una brillante espressione transgenica nell'RPE al momento dello screening per l'ablazione genetica.
La criosezione trasversale della larva post-fecondazione nonblata di sei giorni ha mostrato che l'espressione transgenica era limitata alle cellule RPE mature con l'espressione più brillante confinata ai 2/3 centrali dell'RPE. Le punte di freccia indicano microvilli apicali. La criosezione trasversale di una larva ablata di un giorno dopo l'infortunio ha rivelato un'interruzione della morfologia cellulare positiva all'eGFP.
Le frecce indicano i nuclei picnotici. I danni all'intero monte delle larve post-fecondazione non alatate sette giorni hanno mostrato pigmentazione RPE in tutto l'occhio e le larve ablate post-lesione di due giorni hanno mostrato una zona di ablazione senza pigmento nell'RPE centrale. Un grafico generato utilizzando RpEGEN ha mostrato somiglianze tra i gruppi DMSO post-fecondazione di nove giorni non pubblicati e IWR-1 per tutta la lunghezza dell'RPE.
Il grafico ha mostrato un'intensità complessiva di pixel più leggera nei gruppi Ablati di quattro giorni post-lesione DMSO e IWR-1, che apparivano più leggeri nell'IWR-1 ablato rispetto a qualsiasi altro gruppo di trattamento. Le differenze nella pigmentazione centrale dell'RPE sono state significative quando si confrontano le larve trattate con IWR-1 ablato con i controlli trattati con DMSO ablato. Utilizzando questo paradigma di ablazione del pesce zebra, siamo stati in grado di identificare diverse vie di segnalazione molecolare, come la segnalazione del vento che abbiamo mostrato qui, che sono regolatori critici della rigenerazione RPE.
