I pareri o le affermazioni contenute nel presente documento sono le opinioni personali degli autori e non devono essere interpretate come ufficiale o quanto riflette le opinioni del Dipartimento dell&#39;Esercito o il Dipartimento della Difesa. Questa ricerca è stata eseguita mentre Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, e Ramesh R. Kaini gli autori hanno tenuto una Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche presso l&#39;USAISR. Microarray sono stati eseguiti dai bambini del Greehey Cancer Research Institute Microarray Nucleo Facility e Bioinformatica Dipartimento presso UT Health Science Center a San Antonio. Questo lavoro è stato supportato dal US Army programma clinico di Medicina Riabilitativa Research (CRMRP) e militare Programma di Ricerca Operativa Medicina (MOMRP).

1. Preparazione della Cultura Reagenti e piastre di coltura <ol><li> mTeSR1 Media: Preparare il supporto mTeSR1 secondo le istruzioni del produttore. Scongelare 100 ml di mTeSR1 5x supplemento notte a 4 ° C. Aggiungere 100 ml di mTeSR1 5x complemento a 400 ml di mTeSR1 terreni di base e mescolare bene. Questo supporto è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi. </li><li> Differenziazione dei media: Preparare il supporto differenziazione DMEM/F12 per produrre 0.1mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2.0 mM L-glutammina, siero knockout del 10%, e 10 mg / ml di gentamicina. </li><li> iPS-RPE supporto: preparare iPS-RPE media in MEM cedere supplemento 1x N1, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 250 mg / ml taurina, 13 ng / ml sale di sodio triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mcg / ml gentamicina, e 15% FBS 26. </li><li> Soluzione madre sale sodico triiodo-L-thyronine. Per preparare soluzione madre sciogliere 1,0 mg di triiodo-L-thyroninesale di sodio in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Successivamente aggiungere 49,0 ml di mezzi di comunicazione di base per rendere 50,0 ml di 20 mg / ml di sale di sodio triiodo-L-thyronine. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale. </li><li> Idrocortisone soluzione madre: Per preparare una soluzione madre idrocortisone, solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo assoluto agitando. Successivamente aggiungere 19,0 ml di mezzi di comunicazione di base per la soluzione di 20 ml di idrocortisone magazzino di 50 mg / ml. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. Utilizzare volume adeguato per raggiungere la concentrazione desiderata in mezzi di coltura finale. </li><li> Fetale crescita media RPE. Preparare i mezzi di crescita miscelando tutti i reagenti nel kit RTEGM nei media basale, secondo le istruzioni del produttore eccezione del FBS. </li><li> Mezzi di placcatura RPE fetale. Preparare terreni in piastra trasferendo una piccola quantità di terreni di crescita in un contenitore sterile eFBS dd ad una concentrazione finale del 2%. </li><li> Dispasi: Preparare la soluzione di lavoro del dispasi di 1 mg / ml in DMEM/F12. </li><li> Matrigel rivestite con lastre: Preparare Matrigel in DMEM/F12 a 0,08 mg / ml. </li><li> Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1,0 ml della soluzione di matrigel. </li><li> Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1,0 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 1,0 ore, aspirare il DMEM/F12 eccesso. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di media mTeSR1 per evitare l&#39;essiccamento. Le piastre Matrigel rivestite sono ora pronti per l&#39;uso. </li></ol> 2. Cultura iPS <ol><li> Prima della semina delle cellule iPS hanno tutti i tubi, i media caldi mTESR1 a temperatura ambiente, e le piastre Matrigel rivestite pronte. </li><li> Scongelare rapidamente le cellule IMR90-4 iPS in un bagno d&#39;acqua a 37 °. Quindi rimuovere il esageratamente dal bagnomaria e sterilizzare utilizzando 70% di etanolo. </li><li> Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml con una pipetta 2 ml per minimizzare rottura di aggregati cellulari. </li><li> Drop-saggio aggiungere 5 ml di warm supporti mTeSR1 alle cellule e delicatamente mescolare. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e rimuovere il surnatante. </li><li> Risospendere con attenzione gli aggregati di cellule in 2 ml di media mTeSR1 e seminare le cellule su un pozzetto di una piastra ben sei. </li><li> Porre la piastra in un incubatore e la cultura 37 ° con il 5% di CO 2, 95% di umidità. </li><li> Cambiare la coltura delle cellule iPS quotidiana. Colonie indifferenziati appariranno 5-7 giorni dopo la semina. Verificare la presenza di colonie indifferenziati che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso). </li></ol> 3. Passaging di cellule iPS <ol><li> Prima di iniziare a passaggio le cellule iPS, hanno tutte le provette, soluzione dispasi, DMEM/F12 e mTERS1 supporti riscaldata a temperatura ambiente, e la Matrigel rivestite piastre pronta. </li><li> Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l&#39;area e aspirare il media. Differenziazione dovrebbe rimanere inferiore al 20% del pozzo per altacolture di qualità. Sciacquare accuratamente la cella contenente bene con 2 ml DMEM/F12 iPS e aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun bene. </li><li> Incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM/F12 due volte. </li><li> Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di mTSER1 a ciascun pozzetto. </li><li> Usando una pipetta da 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra a formare aggregati. </li><li> Trasferire le colonie staccate in una provetta da 15 ml. Aggiungi mezzi mTeSR1 sufficienti per seminare il prossimo passaggio di cellule. </li></ol> 4. Differenziazione delle cellule iPS per iPS-RPE <ol><li> Piastra le cellule iPS su un piatto rivestito di recente nei media mTESR1. </li><li> Lasciare colonie di cellule iPS per espandere per 4-5 giorni di coltura. </li><li> Supporti di sostituzione mTeSR1 con i media di 4 ml di differenziazione. Cambiare metà dei mezzi ogni 3 giorni. </li><li> Consentire foci pigmentate diventino abbastanza grandi per essere sezionato manualmente della cultura (40-50 giorni). </li><li> Utilizzare un200 microlitri pipetta punta a tagliare intorno e sollevare le colonie pigmentate. </li><li> Raccogliere e mettere in comune le colonie sezionato in un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungere quindi 5 ml di DMEM/F12 alle cellule RPE pool e centrifugare a 300 xg per 5 min due volte. </li><li> Preparare una soluzione singola cellula tramite l&#39;incubazione del pool iPS-RPE con il 0,25% tripsina EDTA. </li><li> Lavare le cellule iPS-RPE con i media iPS-RPE e piastra le cellule raccolte su un nuovo Matrigel rivestite bene in 4 ml di mezzi iPS-RPE. </li><li> Coltivare le cellule per 3 settimane prima di passaggio. Modificare i media ogni 3 giorni. Per l&#39;esperimento, piastra IPS-RPE a 100.000 cellule / cm 2. Raccogliere le cellule il giorno 17. Contare il giorno della semina come giorno 0. </li></ol> 5. Raccolta dei campioni <ol><li> iPS cellule Collection <ol><li> Cultura le cellule iPS fino colonie indifferenziati sono osservate per essere denso al centro. </li><li> Sciacquare le colonie in DMEM/F12. </li><li> Dissociarsi nelle singole cellule utilizzando accutas<html> e. Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12. </li></ol></li><li> Fetale RPE Collection <ol><li> Sciacquare colture cellulari fetale RPE con DMEM/F12 e dissociare nelle singole cellule utilizzando 0,25% tripsina EDTA. </li><li> Raccogliere le cellule in una provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. Risospendere in 2 ml di DMEM/F12. </li></ol></li><li> iPS-RPE cellulare Collection <ol><li> Quando il iPS-RPE raggiungere passaggio 3 e il passaggio 5, raccogliere le celle Giorno 17 dopo il passaggio. Sciacquare iPS-RPE due volte in PBS e preparare una sospensione singola cella mediante incubazione con 1,0 ml di 0,25% tripsina. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 2 ml di ghiaccio freddo supporti iPS-RPE. </li><li> Raccogliere le cellule in un tubo da 15 ml e centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere la sospensione cellulare in 3 ml di tampone colorazione del kit microbead. </li></ol></li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Negativo Selezione del iPS-RPE per rimuovere le cellule indifferenziate <ol><li> Conservare tutti i reagenti a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, ma non funzionano sul ghiaccio. Sospensione cellulare centrifuga dal punto 5.3.4 a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di tampone colorazione del kit microbead a 2 x 10 6 cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di anti-TRA-1-60-PE anticorpi per 2 x 10 6 cellule. </li><li> Mescolare bene e incubare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Lavare le cellule in 1-2 ml di tampone per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 80 ml ​​di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Aggiungere 20 ml di microsfere anti-PE etichettati (dal kit) per 2 x 10 6 cellule. Mescolare bene. Incubare per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1-2 ml di tampone di colorazione per 2 x 10 6 cellule. Centrifugare per 10 min a 300 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 500 &amp; #956; l di tampone di colorazione. </li><li> Separazione cellulare magnetico: <ol><li> Mettere colonna cell sorter magnetico. Risciacquare colonna con 3 ml di tampone di colorazione. </li><li> Applicare sospensione cellulare dal 6,8 su colonna. </li><li> Collocare un tubo al porto negativo per raccogliere le cellule negative TRA-1-60 anni. </li></ol></li></ol> 7. RNA totale estrazione <ol><li> Lisare le cellule eseguendo i campioni attraverso una colonna microcentrifuga omogeneizzatore mini giro disponibile in commercio progettato per minipreps acidi nucleici. </li><li> Estrarre l&#39;RNA totale da cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale con il kit di estrazione di RNA disponibile in commercio progettato per preservare piccole molecole di RNA 27. </li><li> Determinare le concentrazioni di RNA totale utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. </li></ol> 8. Bioanalyzer e Microarray Assay <ol><li> Controllare l&#39;integrità dell&#39;RNA con Bioanalizzatore in combinazione con kit di qualità RNA disponibile in commercio. </li><li> Incubare 100 ng diRNA totale con fosfatasi intestinale di vitello a 37 ° C per 30 min </li><li> Denaturare l&#39;RNA utilizzando il 100% DMSO a 100 ° C per 5 min. </li><li> Etichettare i campioni con PCP-Cy3 utilizzando T4 ligasi tramite incubazione a 16 ° C per 1 ora. </li><li> Ibridare su un formato 8_x_15K matrice miRNA umani. </li><li> Lavare le matrici secondo le istruzioni del fabbricante e la scansione ad una risoluzione di 5 micron utilizzando uno scanner. </li><li> Acquisire i dati usando la funzione microarray software di estrazione compatibili con il microarray miRNA. </li><li> Elaborare i segnali miRNA per determinare il livello relativo di espressione in ogni campione. </li><li> Confrontare i livelli di espressione di ciascuno miRNA tra i gruppi campione. Selezionare miRNA con espressione differenziale di almeno due volte per ulteriori analisi. </li><li> Utilizzo del software disponibile in commercio per l&#39;analisi dei dati, seguire le istruzioni per generare mappe di calore per la visualizzazione dei miRNA differenzialmente espressi 28. </li></ol> 9. Analisi Pathway <ol><li> Salvare i dati dai miRNA selezionati in 8.9 in formato Excel. </li><li> Accedere al programma online di analisi di RNA percorso. Caricare il file di Excel. Selezionare &quot;Format flessibile&quot; per il formato di file e selezionare &quot;Agilent&quot; dal menu a discesa per il tipo identificativo. </li><li> Alla voce dati grezzi, assegnare &quot;ID&quot; per sondare colonna ID e assegnare &quot;Osservazione 1&quot; e &quot;rapporto log&quot; alla colonna razione log. Selezionare &quot;ignora&quot; per tutte le altre colonne. </li><li> Selezionare i parametri per l&#39;analisi come segue: Fiducia: sperimentalmente osservato solo; comprendere le relazioni dirette e indirette; e comprendono prodotti chimici endogeni; Selezionare il Knowledge base Ingenuity come l&#39;insieme di riferimento. Scegliere il database di molecole di riferimento che include i dati di tutte le specie, tutte le linee di cellule e tessuti, e tutte le mutazioni. </li><li> Rete Esegui e percorso di analisi. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In conclusione, la relazione descrive i metodi utilizzati per la coltura delle cellule iPS, iPS-RPE e RPE fetale. RPE derivate da iPS sono morfologicamente e funzionalmente simile a RPE fetale. IPS-RPE esprime anche caratteristici geni RPE tra cui RPE65, CRALBP, PEDF, e LRAT 16. Per caratterizzare ulteriormente queste cellule, l&#39;RNA è stato estratto e utilizzato per eseguire analisi microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi. Analisi delle intensità di segnale rivelato che è stato ril...

Le cellule staminali hanno la capacità di replicarsi senza limiti e il potenziale di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. Lo sviluppo di tecniche per riprogrammare cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti ha suscitato grande entusiasmo nella comunità della ricerca e tra i medici, come l&#39;avvento di rigenerazione del tessuto personalizzato è all&#39;orizzonte 1. Induced-staminali pluripotenti (iPS) presentano le stesse caratteristiche di illimitato potenziale replicativo e pluripotenza come staminali embrionali (ES), le cellule che aggirano i dilemmi etici associati con i CES. Inoltre, le cellule staminali del paziente non stimolare una risposta immunitaria, aumentando notevolmente la probabilità di successo applicazioni terapeutiche 2-3. Sotto specifiche condizioni di coltura, le cellule iPS hanno dimostrato di differenziarsi in diversi tipi cellulari in vitro, compresi cardiomiociti, neuroni, cellule beta pancreatiche, epatociti e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) 4-12. La RPE è uno strato specializzato di cellule epiteliali pigmentate situati nella parte posteriore della retina che svolge diverse funzioni che sono essenziali per la salute visiva e funzione come assorbimento della luce diffusa, fagocitosi dei segmenti esterni dei fotorecettori, e l&#39;elaborazione di retinoidi per la produzione di chromophore visiva. Disfunzione del RPE causa di danni o malattia colpisce profondamente la salute dei fotorecettori e la funzione visiva come testimoniano le malattie accecante che sono il risultato della sottostante patologia RPE come la degenerazione maculare legata all&#39;età (AMD), la malattia di Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Trattamenti veramente efficaci che possono ripristinare la visione non sono stati raggiunti, e la sostituzione di RPE malato con sano RPE può essere l&#39;opzione migliore per prevenire la perdita della visione 14-15. RPE derivate da iPS (iPS-RPE) è una possibile fonte di cellule per sostituire il RPE danneggiato. iPS-RPE esprime caratteristiproteine ​​RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; visualizza la classica altamente pigmentato esagonale RPE morfologia; e svolge funzioni RPE come la fagocitosi, l&#39;elaborazione retinoidi, e la secrezione di 11 - cis 5,16 retinica. Tuttavia, prima di iPS-RPE può essere utilizzato terapeuticamente, IPS-RPE deve essere accuratamente caratterizzato. Comprensione dei fattori che regolano la differenziazione RPE è necessario per migliorare la resa e la purezza delle cellule da utilizzare per applicazioni cliniche. La differenziazione cellulare è il risultato dell&#39;espressione genica altamente regolato. Rimodellamento epigenetico del genoma e del coordinamento dei fattori di trascrizione sono necessari per le decisioni destino delle cellule che si verificano durante la differenziazione e lo sviluppo 17. Regolamento del messaggio RNA messaggero (mRNA), traduzione di microRNA (miRNA) presenta ancora un altro livello di regolamentazione che riguarda il destino delle cellule 1. MiRNAs sono brevi, ~ 22 nt, lunghezze di nucleotidi che sia la traduzione di soppressione dalegame al 3 &#39;UTR del mRNA bersaglio o l&#39;mRNA per degradazione. MiRNAs sono stati rilevati in quasi tutti i tessuti e ad oggi oltre 2.000 microRNA umani unici sono stati registrati nel database miRBase. Poiché miRNA richiedono complementarità soltanto parziale di legarsi al mRNA bersaglio, un singolo miRNA può potenzialmente legarsi a decine o centinaia di bersagli, e viceversa, cioè un singolo mRNA può essere bersaglio di diversi miRNA diversi. Questa caratteristica vincolante promiscua aumenta notevolmente il livello di complessità della regolamentazione, così come il livello di difficoltà di determinare le funzioni dei singoli miRNA e il ruolo ognuno gioca in funzioni cellulari 18-21. Tuttavia, studi hanno dimostrato che miRNA raffina genica durante il differenziamento influenzando stato di metilazione del DNA 17. In uno studio più specifico al RPE, miR-204/211 ha dimostrato di promuovere il fenotipo epiteliale della RPE 22. Un altro gruppo ha analizzato il profilo di miRNAdi RPE durante il differenziamento di cellule ES e ha rivelato insiemi distinti di miRNA sono espressi durante il processo di differenziazione 23. In realtà, i profili miRNA possono distinguere in modo inequivocabile tipi cellulari, comprese le cellule staminali, cellule precursori e cellule terminalmente differenziate 24,25. Oltre 250 miRNA sono espressi nella retina. Sulla base di questi studi, ipotizziamo che i microRNA svolgono un ruolo importante durante la differenziazione di RPE da iPS. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per il differenziamento di RPE da IMR90-4 cellule iPS, la raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA che sono differenzialmente espressi fra tre tipi di cellule, le cellule iPS , iPS-RPE e RPE fetale. L&#39;RNA totale è stato estratto da colture di ogni tipo di cellula e ibridato a un microarray miRNA, contenente sonde specifiche per il 1205 miRNA umani e 144 miRNA virali. I risultati microarray sono stati confrontanod per determinare quali miRNA sono differenzialmente espressi tra i diversi tipi cellulari. miRNA con 2 volte o più fold change in espressione sono stati selezionati per ulteriore analisi. Un programma software di analisi miRNA è stato usato per identificare potenziali target dei miRNA differenzialmente espressi e generare reti cellulari regolati dai miRNA selezionati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td style="width:156px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">5850</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:235px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">MEM media</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Taurine</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium salt</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:156px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal RPE media RTEGM kit</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">195406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Dispase</td>
			<td style="width:156px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Matrigel</td>
			<td style="width:156px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Trypsin</td>
			<td style="width:156px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td style="width:119px;">25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec washing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec rinsing buffer</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-092-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Anti-TRA-1-60 microbead kit</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-095-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Miltenyi Biotec cell sorter column</td>
			<td style="width:156px;">StemGent</td>
			<td style="width:119px;">130-021-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNeasy micro kit</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">QIA shredder</td>
			<td style="width:156px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">RNA 6000 Pico LabChip kit</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2938-90046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:235px;">Human miRNA microarray v16</td>
			<td style="width:156px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G4471A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microrna expression profiles of human ips cells, retinal pigment epithelium derived from ips, and fetal retinal pigment epithelium

L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per confrontare il microRNA (miRNA) profili di umana indotta staminali pluripotenti (iPS), dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivato da cellule iPS umane (iPS-RPE), e RPE fetale. I protocolli includono raccolta di RNA per l&#39;analisi mediante microarray e l&#39;analisi dei dati di microarray per identificare miRNA differenzialmente espressi tra i tre tipi di cellule. I metodi per la coltura di cellule iPS e RPE fetale sono spiegati. Il protocollo utilizzato per la differenziazione di RPE da IP umano è anche descritto. La tecnica di estrazione dell&#39;RNA descriviamo stato selezionato per consentire il recupero massimo molto piccolo RNA per l&#39;uso in un microarray miRNA. Infine, via cellulare e analisi della rete dei dati di microarray è spiegato. Queste tecniche facilitare il confronto dei profili miRNA di tre differenti tipi cellulari.

cellule iPS (Figura 1A) sono state coltivate in condizioni di differenziazione di indurre il differenziamento in cellule iPS-RPE. IPS-RPE esposto classico fenotipo RPE di esagonale morfologia cellulare pigmentato (Figura 1B) simile a RPE fetale (Figura 1C). Per comprendere meglio il ruolo che può svolgere miRNA durante il processo di differenziazione da iPS a iPS-RPE, analisi di microarray di espressione dei miRNA è stata condotta. L&#39;R...

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MicroRNA Expression Profiles of Human iPS Cells, Retinal Pigment Epithelium Derived From iPS, and Fetal Retinal Pigment Epithelium

I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati.

MicroRNA Expression Profili di cellule iPS umane, dell&#39;epitelio pigmentato retinico derivate da iPS, e fetale dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The objective of this report is to describe the protocols for comparing the microRNA (miRNA) profiles of human induced-pluripotent stem (iPS) cells, ...

microrna-expression-profiles-human-ips-cells-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  JBSA Fort Sam Houston.  I microRNA (miRNA) profili di staminali umane pluripotenti indotte-(iPS), cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivati ​​da umana indotta staminali pluripotenti (iPS) (iPS-RPE), e RPE fetale, sono stati confrontati. 

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Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

Ricerca

Biologia

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the eye. It is a single sheet of pigmented cells that are hexagonally packed and connected by tight junctions. The main functions of the RPE include absorption of light, phagocytosis of the shed photoreceptor outer segments, spatial buffering of ions, transport of nutrients, ions and water as well as active involvement in the visual cycle. With such important and diverse functions, it is critically important to study the biology of RPE cells. A number of RPE cell lines have been established; however, passaged and immortalized cells are known to quickly lose some of the morphological and physiological characteristics of natural RPE cells. Thus, primary cells are more suitable for studying different aspects of RPE cell biology and function. Mouse primary RPE cell culture is very useful to researchers since mouse models are widely used in biological studies, however collecting RPE cells from mouse is also very challenging due to their small size. Here, we present a protocol for establishing primary mouse RPE cell cultures which includes enucleation and dissection of the eyes and isolation of the RPE sheets to yield the cells for culturing. This method enables efficient cell recovery. The RPE cells obtained from two mice&#160;can reach confluency on one 12 mm polyester membrane insert pre-loaded in culture plate after one week of culture and display some of the original properties of bona fide RPE cells such as hexagonal shape and pigmentation after two weeks of culture.

The retinal pigment epithelium (RPE) is a multi-functional epithelium of the eye. Here we present a protocol to establish primary cell cultures derived from the murine RPE.

Colture cellulari primarie dall'epitelio retinico del pigmento del Mouse

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

Ablazione mediata da nitrorefuttasi/metronidazolo e una piattaforma MATLAB (RpEGEN) per lo studio della rigenerazione dell'epitelio pigmentato retinico zebrafish

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...

Primary Culture of Porcine Retinal Pigment Epithelial Cells

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. Multiple functions, including phagocytosis, nutrient/metabolite transportation, vitamin A metabolism, etc., are conducted by the RPE on a daily basis. RPE cells are terminally differentiated epithelial cells with little or no regenerative capacity. Loss of RPE cells results in multiple eye diseases leading to visual impairment, such as age-related macular degeneration. Therefore, the establishment of an in vitro culture model of primary RPE cells, which more closely resembles the RPE in vivo than cell lines, is critical for the characteristic and mechanistic studies of RPE cells. Considering the fact that the source of human eyeballs is limited, we create a protocol to culture primary porcine RPE cells. By using this protocol, RPE cells can be easily dissociated from adult porcine eyeballs. Subsequently, these dissociated cells attach to culture dishes/inserts, proliferate to form a confluent monolayer, and quickly re-establish key features of epithelial tissue in vivo within 2 wks. By qRT-PCR, it is demonstrated that primary porcine RPE cells express multiple signature genes at comparable levels with native RPE tissue, while the expressions of most of these genes are lost/highly reduced in human RPE-like cells, ARPE-19. Moreover, the immunofluorescence staining shows the distribution of tight junction, tissue polarity, and cytoskeleton proteins, as well as the presence of RPE65, an isomerase critical for vitamin A metabolism, in cultured primary cells. Altogether, we have developed an easy-to-follow approach to culture primary porcine RPE cells with high purity and native RPE features, which could serve as a good model to understand RPE physiology, study cell toxicities, and facilitate drug screenings.

Here, an easy-to-follow method to culture primary porcine retinal pigment epithelial cells in vitro is presented.

Coltura primaria di cellule epiteliali pigmentate retiniche suine

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of polarized pigmented epithelial cells, located between the choroid and neuroretina in the retina. ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...

Efficient and Consistent Generation of Retinal Pigment Epithelium/Choroid Flatmounts from Human Eyes for Histological Analysis

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and vision. Proteins on the RPE apical surface are tightly associated with proteins on the photoreceptor outer segment surface, making it difficult to consistently separate the RPE from the photoreceptors/retina. We developed a method to efficiently separate the retina from the RPE of human eyes to generate complete RPE/choroid and retina flatmounts for separate cellular analysis of the photoreceptors and RPE cells. An intravitreal injection of a high-osmolarity solution of D-mannitol, a sugar not transported by the RPE, induced the separation of the RPE and retina across the entire posterior chamber without causing damage to the RPE cell junctions. No RPE patches were observed attached to the retina. Phalloidin labeling of actin showed RPE shape preservation and allowed morphometric analysis of the entire epithelium. An artificial intelligence (AI)-based software was developed to accurately recognize and segment the RPE cell borders and quantify 30 different shape metrics. This dissection method is highly reproducible and can be easily extended to other animal models.

We describe a method to efficiently separate retinal pigment epithelium (RPE) from the retina in human eyes and generate whole RPE/choroid flatmounts for histological and morphometric analyses of the RPE.

Generazione efficiente e coerente di epitelio/coroide pigmentato retinico Flatmounts da occhi umani per analisi istologiche

The retinal pigment epithelium (RPE) and retina are functionally and structurally connected tissues that work together to regulate light perception and ...

Isolation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Guinea Pig Eyes

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential application in molecular biology studies, including gene expression analyses. In the context of eye growth regulation and myopia, the RPE likely plays a role as a cellular relay for growth modulatory signals, as it is located between the retina and the two walls of the eye, such as the choroid and sclera. While protocols for isolating the RPE have been developed for both chicks and mice, these protocols have proven not to be directly translatable to the guinea pig, which has become an important and widely used mammalian myopia model. In this study, molecular biology tools were used to examine the expression of specific genes to confirm that the samples were free of contamination from the adjacent tissues. The value of this protocol has already been demonstrated in an RNA-Seq study of RPE from young pigmented guinea pigs exposed to myopia-inducing optical defocus. Beyond eye growth regulation, this protocol has other potential applications in studies of retinal diseases, including myopic maculopathy, one of the leading causes of blindness in myopes, in which the RPE has been implicated. The main advantage of this technique is that it is relatively simple and&#160;once perfected, yields high-quality RPE samples suitable for molecular biology studies, including RNA analysis.

We describe a simple and efficient method for isolating cells of the retinal pigment epithelium (RPE) cells from the eyes of young pigmented guinea pigs. This procedure allows for follow-up molecular biology studies on the isolated RPE, including gene expression analyses.

Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

This protocol describes the isolation of cells of the retinal pigment epithelium (RPE) from the eyes of young pigmented guinea pigs for potential ...

Modellazione e analisi della degenerazione retinica

LipidUNet-Machine Learning-Based Method of Characterization and Quantification of Lipid Deposits Using iPSC-Derived Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of hexagonal cells located at the back of the eye. It provides nourishment and support to photoreceptors and choroidal capillaries, performs phagocytosis of photoreceptor outer segments (POS), and secretes cytokines in a polarized manner for maintaining the homeostasis of the outer retina. Dysfunctional RPE, caused by mutations, aging, and environmental factors, results in the degeneration of other retinal layers and causes vision loss. A hallmark phenotypic feature of degenerating RPE is intra and sub-cellular lipid-rich deposits. These deposits are a common phenotype across different retinal degenerative diseases. To reproduce the lipid deposit phenotype of monogenic retinal degenerations in vitro, induced pluripotent stem cell-derived RPE (iRPE) was generated from patients&#39; fibroblasts. Cell lines generated from patients with Stargardt and Late-onset retinal degeneration (L-ORD) disease were fed with POS for 7 days to replicate RPE physiological function, which caused POS phagocytosis-induced pathology in these diseases. To generate a model for age-related macular degeneration (AMD), a polygenic disease associated with alternate complement activation, iRPE was challenged with alternate complement anaphylatoxins. The intra and sub-cellular lipid deposits were characterized using Nile Red, boron-dipyrromethene (BODIPY), and apolipoprotein E (APOE). To quantify the density of lipid deposits, a machine learning-based software, LipidUNet, was developed. The software was trained on maximum-intensity projection images of iRPE on culture surfaces. In the future, it will be trained to analyze three-dimensional (3D) images and quantify the volume of lipid droplets. The LipidUNet software will be a valuable resource for discovering drugs that decrease lipid accumulation in disease models.

Autore in primo piano: Svelare la patogenesi della degenerazione maculare legata all'età e scoprire potenziali terapie 

Degenerative eye diseases that affect the retinal pigment epithelium layer of the eye have monogenic and polygenic origins. Several disease models and a software application, LipidUNet, have been developed to study mechanisms of disease, as well as potential therapeutic interventions.

Metodo basato sull'apprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC