Iniziare centrifugando la sospensione di cellule cerebrali isolate a 300 G per otto minuti. Risospendere il pellet in 80 microlitri di HBSS con soluzione 0,5%BSA. Aggiungere 20 microlitri di cocktail di anticorpi biotina di cellule non neuronali e incubare.
Lavare le celle con due millilitri di HBSS con 0,5% di BSA. Quindi risospendere il pellet della centrifuga in 80 microlitri di HBSS con 0,5% di BSA. Ora aggiungi 20 microlitri di microsfere anti-biotina e pipetta per mescolare accuratamente.
Dopo l'incubazione a freddo, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione HBSS BSA. Installare il supporto prima di risciacquare la colonna con 0,5 millilitri di HBSS con 0,5% di BSA. Quindi posizionare una provetta da 15 millilitri sotto la colonna e far passare 0,5 millilitri di sospensione cellulare attraverso di essa.
Eseguire tre lavaggi con 0,5 millilitri di HBSS con soluzione BSA allo 0,5% per catturare le cellule neuronali residue. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla all'interno di un nuovo tubo da 15 millilitri. Aggiungere un millilitro di HBSS con 0,5% di BSA e utilizzare lo stantuffo per raccogliere le cellule non neuronali marcate magneticamente.
Dopo la centrifugazione cellulare, risospendere le cellule in un millilitro di HBSS con una soluzione di BSA allo 0,5%. Contare le cellule su una camera di conteggio Neubauer al microscopio in campo chiaro. I neuroni LepR positivi hanno iniziato a formare neuriti dopo 48 ore.
A DIV4 le estensioni assonali hanno mostrato progressi mentre i processi dendritici hanno iniziato a comparire. A DIV6 i neuroni erano sufficientemente sviluppati. Studi di immunofluorescenza hanno dimostrato che non sono state osservate cellule gliali o altre cellule non neuronali.
La natura neuronale delle cellule è stata confermata dalla colorazione della proteina due associata ai microtubuli. Al DIV10 il 30% delle cellule LepR positive ha espresso POMC. La connettività e la funzionalità sinaptica sono state osservate in colture generali contenenti popolazioni neuronali ipotalamiche eterogenee.
