Misurando le proprietà elettrofisiologiche delle membrane cellulari, la questione del principale dimostra che modulare l'attività elettrica di una cellula può essere risolta. La registrazione del patch clamp dell'intera cellula è una tecnica periferica per studiare le correnti ioniche nelle singole cellule e interrogare la risposta cellulare a diversi stimoli. Le migliori prestazioni sulle pre-registrazioni di patch clamp a cellule intere saranno raggiunte dopo aver praticato e studiato molto.
Per iniziare la dissezione cerebrale fare un'incisione usando forbici chirurgiche nella pelle nella parte superiore del cranio dell'animale decapitato dal caudle al rostrale e rimuovere il cuoio capelluto. Quindi, tagliare la piastra interparietale lungo la sutura sagittale con le forbici dell'iride e rimuovere l'osso occipitale. Far scorrere l'osteotomo sotto l'osso parietale e tirarlo delicatamente fuori fino a quando il cervello è esposto.
Dopo aver esposto il cervello, capovolgi la testa. Abbassare delicatamente il cervello per visualizzare il nervo trigemino su ciascun lato. Quindi tagliare il nervo trigemino usando le forbici curve Castroviejo.
Dopo aver visualizzato l'ipotalamo identificare il nervo ottico e tagliarlo delicatamente. Quindi, tagliare la porzione anteriore del lobo frontale. Rimuovere il cervello e immergerlo immediatamente nella soluzione di affettatura fino ad acquisire le fette.
Per tagliare i campioni di cervello, posizionare il cervello su una carta da filtro per asciugare la soluzione in eccesso. Quindi con una lama di rasoio tagliente affilata eseguire un taglio coronale separando il tronco cerebrale con il cervelletto dal resto del tessuto. Quindi, incollare la porzione caudle del cervello alla base di un vibratomo e riempire la camera del dispositivo di affettatura con la soluzione di affettatura o la soluzione aCSF raffreddata da zero a due gradi Celsius.
Imballare ghiaccio secco intorno alla camera di vibratomo per mantenere fredda la soluzione affettante durante la procedura. Inserire la lama del rasoio nella vibratoma e impostare i parametri di taglio del dispositivo, come la velocità a tre, la frequenza a nove e l'alimentazione a 250 micrometri. Durante la procedura di affettatura del tessuto trasferire le fette utilizzando una pipetta di trasferimento acrilico nella camera di recupero e attendere 60 minuti per il recupero del tessuto dopo l'acquisizione della fetta.
Prima di iniziare la sigillatura e la registrazione delle cellule, accendere il microscopio, l'amplificatore, il digitalizzatore e il micromanipolatore. Costruire la camera di registrazione collegata al microscopio con la soluzione aCSF. Utilizzare una pompa di perfusione per perfondere costantemente l'aCSF a due millilitri al minuto.
Controlla le impostazioni del software e crea protocolli specifici per le registrazioni in base al tipo di esperimento. Trasferire una fetta di cervello di interesse una alla volta nella camera di registrazione usando una pipetta di trasferimento acrilica. Tenere la fetta con un ancoraggio di fetta in modo che non si muova durante la perfusione aCSF.
Posizionare la fetta al centro della camera di registrazione utilizzando l'obiettivo a bassa potenza del microscopio ad immersione, 10X o 20X. La posizione della fetta è fondamentale per consentire una buona visione della regione desiderata al microscopio e per una portata perfetta per la micropipetta di registrazione. Dopo aver individuato la regione di interesse, passare la lente dell'obiettivo alla lente ad alta potenza, 63X e concentrarsi sul livello del tessuto osservando la proteina fluorescente endogena e le forme delle cellule nella regione bersaglio per localizzare le cellule kisspeptina sulla superficie della fetta di cervello.
Quando si trova una possibile cella di destinazione, contrassegnarla sullo schermo del computer con il cursore del mouse o disegnando un formato come un quadrato sopra l'area di interesse. Il segno dello schermo del computer aiuta a guidare la posizione della pipetta di registrazione verso la cella. Dopo aver determinato la posizione esatta della cella bersaglio, sollevare l'obiettivo e introdurre la micropipetta di registrazione riempita con la soluzione interna nel supporto dell'elettrodo assicurandosi che la soluzione interna sia a contatto con l'elettrodo d'argento.
Applicare una pressione positiva prima di immergere la micropipetta nella soluzione aCSF utilizzando una siringa riempita d'aria da uno a tre millilitri collegata al supporto della micropipetta attraverso un tubo di polietilene per evitare che i detriti entrino nella micropipetta. Utilizzando il micro manipolatore guidare la micropipetta sotto il centro dell'obiettivo. Spostare i pulsanti del micromanipolatore per guidare l'asse XYZ della micropipetta verso la cella di interesse.
Regolare la messa a fuoco per vedere la punta della micropipetta e avvicinare la messa a fuoco, ma non troppo vicino alla fetta. Ridurre la velocità del micromanipolatore e abbassare lentamente la micropipetta fino al piano di messa a fuoco, assicurandosi che la punta della micropipetta non penetri bruscamente nella fetta, ma scenda lentamente fino a toccare la superficie della cella o la regione target. Applicare una leggera pressione positiva con una siringa riempita d'aria da uno a tre millilitri per rimuovere eventuali detriti dal percorso di avvicinamento.
Spostare lentamente il micromanipolatore sull'asse XYZ per avvicinare la punta della micropipetta e toccare la cella bersaglio che provoca una fossetta a causa della pressione applicata. Dopo aver stabilito la fossetta con l'aiuto della modalità di morsetto di tensione sul software, applicare una breve aspirazione debole per bocca per uno o due secondi attraverso il tubo collegato al supporto della micropipetta per generare la tenuta tra la micropipetta e la cella. Se la tenuta rimane meccanicamente stabile senza interferenze di rumore per circa un minuto, impostare la tensione di mantenimento al potenziale di riposo fisiologico più vicino della cella di interesse.
Per i neuroni ipotalamici kisspeptin meno 50 millivolt è raccomandato. Quindi, applicare una breve aspirazione per via orale per rompere la membrana plasmatica sulla punta della micropipetta sigillata posizionata sulla cellula in modo che la membrana rotta non ostruisca la micropipetta o attiri una porzione di membrana considerevole o la cellula. Un'adeguata configurazione dell'intera cella può essere ottenuta eseguendo l'aspirazione con forza sufficiente.
Controllare il manuale delle impostazioni di sistema utilizzato. Dopo aver rotto la membrana della cella, abilitare l'opzione dell'intera cella in modalità morsetto di tensione e fare clic sul comando automatico che si riferisce all'intera scheda della cella. La resistenza in serie della cella e la capacità dell'intera cella vengono calcolate automaticamente e visualizzate istantaneamente dal software.
Quindi, controllare i parametri di vitalità delle celle nel software come descritto nel manoscritto di testo. Monitorare la resistenza in serie e la capacità di stato stazionario della cella durante gli esperimenti. Una volta raggiunta correttamente la configurazione dell'intera cella, misurare le correnti sinaptiche in modalità morsetto di tensione.
Registrare le variazioni del potenziale di membrana a riposo e le variazioni del potenziale di membrana a riposo indotto nella modalità di morsetto corrente. I possibili effetti dell'ormone della crescita umano ricombinante sull'attività dei neuroni ipotalamici kisspeptin sono stati studiati con l'aiuto di registrazioni di patch clamp a cellule intere. La somministrazione dell'ormone della crescita umano ricombinante, HGH a 20 microgrammi per grammo ha indotto una significativa iperpolarizzazione del potenziale di membrana a riposo in 5 su 12 neuroni AVPV / PeN kisspeptin e 9 su 14 neuroni ARH kisspeptin registrati.
I neuroni iperpolarizzati AVPV/PeN kisspeptin e ARH kisspeptin hanno modificato significativamente il potenziale di membrana a riposo rispetto alle cellule non responsive. Gli effetti sul potenziale di membrana a riposo durante l'applicazione di HGH hanno seguito una significativa riduzione della resistenza di input dell'intera cellula di circa 0,9-0,7 gigaohm sui neuroni kisspeptin AVPV / PeN e da 1,7 a 1,0 gigaohm sui neuroni ARH kisspeptin. Durante le linee cerebrali perfette eseguite tramite un'attenta gigaseal e l'area della cellula tramite spiaggia, sono necessari parametri per ottenere le migliori registrazioni di cellule intere.
La soluzione di micropipette della cellula registrata può essere raccolta e utilizzata per RTPCR a singola cellula consentendo la caratterizzazione molecolare di una cellula isolata. La tecnica del patch clamp a cellule intere combinata con l'uso di animali geneticamente modificati rappresenta una svolta nella comprensione della riproduzione che consente la definizione di neuroni kisspeptina maggiori proprietà e sono importanti modulatori.
