NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

1. Animali <ol><li> Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l&#39;Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey. </li><li> Casa di gruppo maschile C57BL / 6 topi su un light/12 hr pianificazione buio 12 ore e permettere ad libitum accesso ad acqua e cibo. Sacrifica a 4-5 mesi di età. L&#39;eutanasia dei topi è stata effettuata utilizzando il piano chirurgico di anestesia e una forma secondaria di eutanasia (cioè penetrante incisione nella cavità toracica attraverso la membrana). Ciò è coerente con gli orientamenti AVMA sull&#39;eutanasia. </li></ol> 2. Preparazione della perfusione Solution, vetrini, pipette di vetro, e dei media <ol><li> Preparare la soluzione di perfusione 1L comprensivi di 2,5 mM KCl, 7 MgCl 2 mM, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 NaHCO mm 3, 0.5 mM CaCl 2, glucosio 7 mm, 1 ascorbato mM, e piruvato 3 mm distillata dH 2 O. Regolare l&#39;osmolarità a ~ 300 mOsm usando approssimativamente 80 g / L di saccarosio. Ossigenare facendo gorgogliare con 95% O 2/5% di CO 2 e regolare il pH a 7,4. Ogni esperimento richiede di circa 200 ml di soluzione di perfusione. Aliquote possono essere conservati a -20 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Fai da 250 ml Neurobasal archivio contenente i media Neurobasal senza glucosio, 2,5 mM di glucosio, e 100 U / ml penicillina di streptomicina. Regolare l&#39;osmolarità dello stock Neurobasal a 280 mOsm con saccarosio. Fai 500 ml Hibernate magazzino contenente Hibernate-A supporto senza glucosio, 2,5 mM di glucosio, e 100 U / ml penicillina di streptomicina. </li><li> Mescolare entrambi i titoli bene e filtro sterilizzare utilizzando Stericup unità filtranti vuoto. Fare attenzione a non introdurre glucosio o altri contaminanti attraverso le sbarre vetro o agitare. Avvolgere le bottiglie in un foglio per proteggere i supporti dalla luce e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Fiamma le punte dei 4 pipette di vetro autoclave (9), in modo che le punte non sono lodiametri nger taglienti e l&#39;apertura sono grandi (~ 0,9 millimetri), medio-grande (~ 0,7 mm), medio (~ 0,5 mm) e piccolo (~ 0.3 mm). Il più grande opportuno malapena lucido e il più piccolo dovrebbe essere di circa un terzo di quel diametro. </li><li> Il giorno prima i neuroni di raccolta, puliti quattro vetrini 25 millimetri con il 70% di etanolo e passano sopra una fiamma del bruciatore Bunsen. Mettete ogni vetrino in una sterile 35 millimetri capsula di Petri e aggiungere 2 ml sterile 1% di poli-D-lisina in dH 2 O. Mettere i piatti in un incubatore (37 ° C) durante la notte. Il giorno dopo, lavare con dH 2 O sterile 3x e permettere coprioggetto asciugare completamente. </li><li> Fai 75 aliquote microlitri di 1 M di acido lattico e 200 microlitri aliquote di GlutaMAX; conservare a -20 ° C. Scongelare completamente aliquote di acido lattico e GlutaMAX prima dell&#39;uso per garantire l&#39;omogeneità. </li><li> Il giorno dei neuroni di raccolta, fare 30 ml di mezzo di coltura fresco, comprensivi di Hibernate-A magazzino contenente acido lattico 1mM, 0,5 mm GlutaMAX, e il 2% B27 senza insulina. VoRTEX e aggiustare il pH a 7,4 con 1 N NaOH. </li><li> Mettere 10 ml di coltura in una piastra di Petri 60 millimetri di vetro su ghiaccio, mettere 2 ml in un tubo da 15 ml su ghiaccio e mantenere la carta residua a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno dei neuroni di raccolta, fare 25 ml di terreni di coltura fresco, comprensivi di Neurobasal magazzino contenente 1 mM di acido lattico, Glutamax 0,5 mm, 2% B27 senza insulina. Vortex e aggiustare il pH a 7,4 con 1 N NaOH. Lasciare i mezzi di crescita fresco equilibrare in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per almeno 30 min. </li></ol> 3. Perfusione cardiaca <ol><li> Scongelare completamente soluzione di perfusione ml 200 e ossigenato con il 95% O 2/5% di CO 2 in ghiaccio per almeno 15 minuti. </li><li> Lavare una lama vibratome con acetone, etanolo al 70%, e dH 2 O. Posizionare la lama in vibratome. </li><li> Sciacquare la camera di raffreddamento vibratome e tubo per perfusione con dH 2 O. Riempire la camera di raffreddamento (4 ° C) Con la soluzione di perfusione e continuare a ossigenare. </li><li> Anestetizzare un mouse con sodio pentobarbital 50 mg / ml, diluito 1:1 con acqua sterile, iniettata per via intraperitoneale. Verificare che il mouse è completamente anestetizzato da pizzicare la coda e osservando nessuna risposta. </li><li> Versare liquido di perfusione fredda nel serbatoio perfusione e tubo appena prima dissezione. Salvare 20-30 ml per la dissezione del cervello e continuano a ossigenare sul ghiaccio. Flusso di gravità da un elevato siringa da 60 ml con tubo e un ago G 20 fornisce un flusso sufficiente. Lasciare la soluzione di eseguire fino a quando le bolle d&#39;aria vengono lavati. Continuare a ossigenare. </li><li> Tagliare la pelle sopra la gabbia toracica del mouse. Sollevare la cassa toracica e fare attenzione un taglio orizzontale attraverso il diaframma. Fare due tagli laterali attraverso la gabbia toracica su verso le braccia per esporre il cuore. Usare pinze per trattenere la cassa toracica. </li><li> Fare un piccoli 2 mm Taglio nell&#39;atrio destro per fornire un punto di uscita per il sangue da lavare fuori dalla vascolarizzazionesistema lar. </li><li> Forare il ventricolo sinistro con l&#39;ago perfusione, quanto basta per inserire l&#39;apertura dell&#39;ago. Mantenere l&#39;ago in posizione con una mano e avviare il flusso di liquido di perfusione con l&#39;altra mano. Dopo 10-15 ml di soluzione di perfusione, il sangue va lavato fuori e l&#39;effluente sarà chiaro. </li></ol> 4. Cervello affettare e dissezione <ol><li> Dopo perfusione cardiaca, trasferimento ossigenato liquido di perfusione fredda per una piastra di Petri su ghiaccio appena prima dell&#39;uso. </li><li> Rapidamente decapitare, rimuovere il cervello dal cranio e posizionare il cervello nella soluzione di perfusione. Per rimuovere il cervello: tirare la pelle in avanti, fare un taglio linea mediana nel cranio verso le orbite, fare due tagli laterali verso ciascun occhio, usare il forcipe per tirare indietro ogni lato del cranio, fare un taglio coronale tra le orbite, e utilizzare una spatola di convincere delicatamente il cervello fuori nella soluzione di perfusione. Usare le forbici per tagliare i tratti ottici, se necessario. Non toccare la ipotalamiArea C e non tirare i tratti ottici, perché questo mette troppa pressione sul eminenza mediana e il tessuto ipotalamico sottostante. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio e ago per tagliare lateralmente tessuto cerebrale di circa 3 mm posteriormente e anteriormente al ipotalamo, mentre il tessuto è sommerso (bregma -3,52 mm). E &#39;particolarmente importante per il taglio lato anteriore sia livello in modo che il cervello si siederà direttamente sul mandrino vibratome. </li><li> Rimuovere il tessuto cerebrale rimanente dalla soluzione e utilizzare carta da filtro per evacuare la soluzione dalla sezione cervello montato. </li><li> Posizionare una piccola quantità di colla super di un mandrino vibratome e diffondere la colla alle dimensioni del cervello. Mettere il tessuto cerebrale in cima alla colla con il lato anteriore rivolto verso il basso e l&#39;ipotalamo fronte alla lama. Wick via eccesso di colla e posizionare il mandrino nella camera di raffreddamento vibratome. Fare attenzione a non lasciare più la colla come sarà la bolla intorno al cervello quando sono immessi in soluzione. </li><li> Con il vibratome impostare una velocità lenta (livello 2) e alta ampiezza (livello 9), fare 300-500 micron fette fino a raggiungere la zona ipotalamica. Ora fare sottili 100 micron fette taglio dal posteriore alla anteriore. I segnali visivi sono i seguenti. Posteriormente al ipotalamo terzo ventricolo sarà molto piccolo (bregma -2,70 a -2,30 mm). A bregma -2.30 mm, il terzo ventricolo viene separato in sezioni dorsale e ventrale sulla fetta coronale. </li><li> Una volta sezioni del terzo fusibile ventricolo, fanno due fette 500 micron che conterranno la corretta regione del VMH (bregma -2.18 a -1.22 mm). Anteriore al VMH, il terzo ventricolo non si estende al pavimento ventrale del cervello (bregma -1.06 a -0.82) 8. </li><li> Trasferire queste fette alla piastra di Petri su ghiaccio contenenti terreni di coltura. Sezionare il VMH (VMN + ARC) come mostrato in Figura 1. Utilizzare una pipetta per trasferire delicatamente i pezzi VMH in 2 ml di coltura sul ghiaccio. </li></ol> 5. Dissociazione e cultura <ol><li> Rimuovere il VMH dal ghiaccio e mettere a temperatura ambiente. Aggiungere 20 U / ml papaina a 4 ml di coltura. Miscelare e posto in un bagno d&#39;acqua a 34 °. Controllare e miscelare capovolgendolo ogni minuto fino a quando il supporto di digestione non è più torbida. Filtro (0,22 micron) in una beuta sterile e trasferire il tessuto ai media digestione. </li><li> Digerire il tessuto mediante agitazione a 100 rpm a 34 ° C per 30 min. </li><li> Preparare 1 ml di terreni contenenti 8% di albumina di siero bovino (BSA) durante la digestione. Disciogliere 80 mg di BSA in 1 ml di terreni di coltura e filtri (0,22 micron) in una provetta conica. </li><li> Lavare il tessuto trasferendo a 5 ml di coltura in una provetta conica e lentamente invertendo volta. </li><li> Aggiungere 30 microlitri DNasi enzima a 6 ml di terreni di coltura e mescolare per fare media triturazione. Aspirare i media lavaggio e aggiungere 3 ml di mezzi di triturazione. </li><li> Utilizzare le pipette di vetro per triturare in ordine di largest al più piccolo. Triturare delicatamente 10x e quindi attendere 4 minuti per pezzi più grandi da risolvere. Utilizzare la seconda pipetta per trasferire le prime 2 ml contenenti una sospensione cellulare dissociata in un tubo conico. Aggiungere 2 ml di mezzi di triturazione, triturare 10x e attendere 3 min. Utilizzare il terzo pipetta per trasferire le prime 2 ml di sospensione cellulare. Aggiungere 1 ml di mezzi di triturazione, 5x triturare e aspettare 2 min. Utilizzare il quarto pipetta di trasferire il 2ml superiore alla sospensione cellulare. </li><li> Strato sospensione cellulare dissociata in cima alla BSA 8%, facendo attenzione a non mescolare. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min. </li><li> Posizionare autoclavato 6 millimetri x 8 mm clonazione cilindri del centro di ogni coprioggetto. Coprivetrini devono essere completamente asciutti. Aspirare e risospendere il pellet in 440 terreni di crescita microlitri caldo. Riempire clonazione cilindri con la sospensione neuronale e posto in incubatrice per 20 min. </li><li> Rimuovere i cilindri di clonazione e molto delicatamente lavare via i detriti. Riempire ogni piatto wi° 2 ml di terreni di crescita. Permettono alle cellule di recuperare per almeno 1 ora prima di ogni test vengono eseguiti. </li></ol> 6. Preparazione per la MPD Imaging <ol><li> Fai la soluzione di registrazione consiste di 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 0.1 mM MgCl 2, 1.2 MgSO mm 4, 0.97 mM K 2 HPO 4, 0.23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3, e 25 mm HEPES. Regolare il pH a 7,4. </li><li> Aggiungi il glucosio per rendere la soluzione di test glucosio basso desiderata (0,1-2,0 mM di glucosio). Mescolare accuratamente e prenotare 400 ml di soluzione di glucosio basso la registrazione. Aggiungi glucosio per i restanti 600 ml di rendere soluzione di registrazione di glucosio 2,5 mm e mescolare accuratamente. </li><li> Proteggere colorante dalla luce il più possibile. Aggiungere 4 ml di tampone a temperatura ambiente in una fiala blu MPD. Mescolare bene e aggiungere 5 ml di colorante per soluzione di registrazione ml. Mantenere soluzione omogenea miscelando con pipetta tra soluzioni. Il colorante fluorescente contiene molecules, che entrano le celle con depolarizzazione e quencher molecole, che non possono attraversare la membrana cellulare. Le aliquote possono essere conservati a -20 ° C ed utilizzati entro 4 giorni. Non congelare e scongelare più di una volta. </li><li> Incubare le cellule in 2 ml di 2,5 mM soluzione di registrazione glucosio più colorante a 34 ° C per 30 min. Un blocco di riscaldamento a secco può essere utilizzato. Proteggere dalla luce. </li><li> Preparare pompe siringa e sistema di perfusione con 2,5 mm e 0,1 mm più soluzioni di registrazione colorante. Tubo da 60 ml siringhe deve essere collegato ad un collettore. </li><li> Dopo aver interrotto ogni pompa, attendere ~ 10 secondi prima di passare a soluzioni collettore per evitare l&#39;accumulo di pressione nella siringa. Le variazioni di pressione alterano la consegna del fluido alla camera chiusa contenente i neuroni, provocando cambiamenti nella messa a fuoco del microscopio durante l&#39;esperimento e la distorsione delle immagini. </li><li> Il tubo di uscita del collettore deve essere collegato a un riscaldatore in linea e poi tubo di polietilene, che si collega a una camera chiusa.<html> Bubbles dovrebbero essere cancellati e il tasso di perfusione deve essere impostato a 0,5 ml / min. Proteggere dalla luce. </li><li> Trasferire 25 millimetri coprioggetto con i neuroni aderenti alla camera chiusa, facendo attenzione a non permettere vetrino a secco e non introdurre bolle d&#39;aria. Lo scorrimento è allineato nelle scanalature del pezzo inferiore, un paio di gocce di soluzione di registrazione viene posizionato lungo i lati, e la parte superiore è leggermente montati per tenere il coprioggetto in posizione. </li><li> Utilizzare un contagocce per riempire la camera con soluzione di registrazione e poi mettere un coprioggetto 18 millimetri sulla parte superiore. Montare delicatamente anello bianco nella camera di tenere il vetrino più piccolo posto. Premere molto lentamente e leggermente per evitare bolle d&#39;aria vengano introdotti nella camera chiusa. </li><li> Avviare la pompa a siringa per la soluzione di registrazione di glucosio 2,5 mm, premere verso il basso l&#39;anello bianco, e collegarsi a camera chiusa. Rilasciare lentamente la pressione anello bianco e collegarsi a tubo che porta a un contenitore per rifiuti. </li></ol>e &quot;&gt; 7. MPD Imaging <ol><li> Centrare i neuroni con la luce campo bassa brillante. Cercare di minimizzare la quantità di tempo le cellule vengono esposte alla luce. </li><li> Lasciare che il sistema di perfusione a correre per 10 minuti per consentire la stabilizzazione della temperatura, messa a fuoco, e colorante equilibrio. </li><li> Mentre adescamento, aprire il programma MetaMorph e prendere in un campo luminoso (10X) dei neuroni. Utilizzare la funzione Auto-Focus prendere 3 pile di immagini fluorescenti (150 msec, filtro Cy3 Narrow, 10X) e la messa a fuoco all&#39;interno di 5 micron. Alla fine del periodo di adescamento 10 min, controllare la messa a fuoco ancora una volta. </li><li> Inizia a registrare le immagini fluorescenti ogni 30 secondi per 40 min. Stabilire una linea di base a glucosio 2,5 mM per 10 minuti, poi diminuire glucosio per 15 min, ed infine ritorno al glucosio 2,5 mM per 15 min. Le soluzioni sono cambiati fermando una pompa a siringa, attesa 10 sec, trasformando una porta sul collettore, e partendo un&#39;altra pompa a siringa. I cambiamenti devono avvenire in anticipo desiderati punti temporali based sul ritardo tra il collettore e le cellule. </li><li> Dopo la registrazione di tutte le immagini fluorescenti, prendere un&#39;immagine luminosa campo dei neuroni. </li></ol> 8. Analisi MPD Imaging <ol><li> Utilizzare MetaMorph per creare regioni ovali intorno ogni cella l&#39;immagine brillante campo scattata al termine dell&#39;esperimento in. Le regioni dovrebbero essere leggermente più grande di ogni neurone e può essere fatta 1 pixel al di fuori del bordo scuro della cellula. Non scegliere le celle che sono malsani, sovrapposizioni, o in prossimità di detriti. Cellule malsane spesso appaiono scure. Infine, creare 5 grandi regioni ovali in aree prive di cellule o detriti per le misurazioni del fondo. </li><li> Trasferire le regioni a tutte le immagini fluorescenti e ispezionare per verificare che non abbia subito nessun movimento / spostamento. Utilizzare la funzione Misura per registrare l&#39;intensità di fluorescenza di ogni regione per tutte le immagini in un file di Excel. Si consiglia l&#39;uso di riviste in Metamorph. </li><li> In Excel, creare una media di 5 regioni di sfondo per ogni flimmagine ent. Questo rappresenta il valore di fondo media ad ogni tempo. Per ogni punto dell&#39;immagine / tempo, sottrarre lo sfondo da tutte le misurazioni regione. L&#39;intensità di fluorescenza di fondo sottratti verrà indicato come Intensity seguito. </li><li> Per ogni cella, calcolare l&#39;intensità media durante 2-8 minuti di registrazione. Questo rappresenta la linea di base della cella in 2,5 mM di glucosio. Un tampone 2 minuto su entrambe le estremità di ogni trattamento viene utilizzato per ridurre il rumore. </li><li> Per ogni cella, calcolare la variazione percentuale dal basale: (Intensity-Baseline) / Baseline </li><li> Creare un grafico linea con la variazione percentuale dal basale vs tempo. </li><li> Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 18-23 minuti. Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 35-40 minuti. Mentre elaborazione delle immagini non viene utilizzato, il rumore viene ridotto mediante la media di intensità all&#39;interno di ciascuna regione cellula, sottrazione dello sfondo, e la media della regione di intensità superiore a 5 min or più. </li><li> Esperimenti di controllo in cui 2,5 soluzione di registrazione mM di glucosio viene scambiato con 2,5 mM di glucosio soluzione di registrazione devono essere eseguite per determinare la soglia di rumore. Calcolare la variazione media percentuale rispetto al basale durante 18-23 minuti per almeno 6 piatti e 3 topi. Determinare la media e deviazione standard di questi valori. </li><li> Impostare la soglia di una risposta positiva alla depolarizzazione media più 2 deviazioni standard. La media più 2 deviazioni standard corrispondente ad una differenza con p &lt;0,05. I nostri esperimenti di controllo hanno rivelato una variazione del 10% rispetto al basale come valore soglia. </li><li> Per ogni cella, valutare la risposta depolarizzazione reversibile basato su 2 criteri. In primo luogo, la variazione media percentuale dal basale durante 18-23 minuti deve essere superiore al 10%, la soglia determinata nel passaggio precedente. In secondo luogo, la variazione media percentuale dal basale durante 35-40 minuti deve essere inferiore alla metà della variazione media percentuale dabasale durante 18-23 minuti. Il secondo criterio è stato scelto poiché è risultato essere più rigorosa di stimolazione con glutammato o KCl. Neuroni malsane spesso rispondono alla stimolazione con glutammato o KCl anche se le loro risposte alla diminuzione di glucosio non sono reversibili. </li><li> Per ogni piatto, calcolare la% di neuroni depolarizzati. Questo valore viene utilizzato per quantificare la% di neuroni GI tra diversi gruppi di trattamento. </li></ol>

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	<li>Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-sensing+neurons:+are+they+physiologically+relevant?.">Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?.</a> Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).</li><li>Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+impairs+glucose+and+insulin+regulation+of+nitric+oxide+production+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).</li><li>Canabal, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose,+insulin,+and+leptin+signaling+pathways+modulate+nitric+oxide+synthesis+in+glucose-inhibited+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamus.">Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus.</a> American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).</li><li>Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMP-activated+protein+kinase+and+nitric+oxide+regulate+the+glucose+sensitivity+of+ventromedial+hypothalamic+glucose-inhibited+neurons.">AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).</li><li>Murphy, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+enhances+the+response+of+arcuate+neuropeptide+Y-glucose-inhibited+neurons+to+decreased+extracellular+glucose.">Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucokinase+is+a+critical+regulator+of+ventromedial+hypothalamic+neuronal+glucosensing.">Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing.</a> Diabetes. 55, 412-420 (2006).</li><li>Kang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prior+hypoglycemia+enhances+glucose+responsiveness+in+some+ventromedial+hypothalamic+glucosensing+neurons.">Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons.</a> Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).</li><li>Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+pre-+and+postsynaptic+influences+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).</li><li>Song, Z., Routh, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+glucose+and+lactate+on+glucosensing+neurons+in+the+ventromedial+hypothalamic+nucleus.">Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus.</a> Diabetes. 54, 15-22 (2005).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

La chiave per poter studiare l&#39;attività dei neuroni da topi adulti è la capacità di dissociare neuroni sani. Dissociazione dei neuroni ipotalamici di topi adulti è più difficile in diversi passaggi chiave nel protocollo rispetto ai neuroni di topi giovani. Abbiamo superare questo problema in vari modi. Fare fette spesse 500 micron di cervello riduce al minimo i danni meccanici ai neuroni rispetto ai soliti 250-350 micron fette utilizzati per il tessuto cerebrale di topi più giovani. Tuttavia, fette spesse rich...

Il cervello regola l&#39;omeostasi energetica attraverso il sistema neuroendocrino e nervoso autonomo. L&#39;ipotalamo ventromediale (VMH), composto dal nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo arcuato (ARC), è importante per la regolazione centrale dell&#39;omeostasi energetica. Specializzati neuroni sensori del glucosio, all&#39;interno del VMH, attività collegamento neuronale e periferico omeostasi del glucosio 1. Ci sono due tipi di glucosio sensing neuroni; glucosio eccitati (GE) neuroni aumentano mentre il glucosio inibita (GI) neuroni diminuiscono la loro attività di aumenti di glucosio extracellulare. Neuroni rilevamento VMH glucosio sono generalmente studiate usando elettrofisiologia o calcio / potenziale di membrana di imaging colorante sensibile. La tecnica patch clamp elettrofisiologia è considerato il gold standard nello studio ex vivo di attività neuronale. In questa tecnica, un elettrodo micropipetta di vetro è attaccato alla membrana cellulare tramite una elevata resistenza(GΩ) sigillo. Elettrodi di patch clamp consentono la registrazione in tempo reale di azione potenziale frequenza (pinza di corrente) o conduttanza ionica (morsetto di tensione) cambia all&#39;interno di un singolo neurone. Mentre la tecnica patch clamp fornisce informazioni dettagliate concernenti le modifiche specifiche conduttanze del canale ionico, un grave inconveniente è che solo neurone può osservata alla volta. Ci vogliono circa 30-45 min di registrazione per verificare che si sta registrando da un neurone di rilevamento del glucosio prima ancora di iniziare un trattamento sperimentale specifico. Inoltre, GI e GE neuroni comprendono &lt;20% della popolazione totale neuronale VMH. Ad aggravare il problema è la mancanza, in molti casi, di un marcatore cellulare per identificare questi neuroni. Pertanto, è chiaro che, nonostante fornendo informazioni elettriche preziose che altre tecniche non possono, analisi patch clamp è laborioso, richiede tempo e bassa resa. L&#39;uso di imaging di fluorescenza dei neuroni VMH dissociate consente lo studio di hundreds di neuroni contemporaneamente. Coloranti sensibili calcio possono essere usati per misurare le variazioni di calcio intracellulare, che indirettamente correlano alle variazioni dell&#39;attività neuronale. Potenziale di membrana coloranti sensibili vengono utilizzati per monitorare membrana potenziali cambiamenti. Misurazione del potenziale di membrana cellulare è un indice più diretta dell&#39;attività neuronale rispetto a variazioni dei livelli di calcio intracellulare. Inoltre, potenziale di membrana immagini colorante (MPD) rileva potenzialmente piccoli cambiamenti nel potenziale di membrana in cui l&#39;azione potenziale di cottura non viene alterata e livelli intracellulari di calcio potrebbe non cambiare. Entrambe queste tecniche di imaging di fluorescenza sono stati utilizzati per studiare i neuroni VMH di rilevamento del glucosio da topi giovanile 2-7. Mentre i risultati sono meno dettagliate di quelle ottenute con patch clamp elettrofisiologia, la forza di esperimenti di imaging è che contemporaneamente valutare una vasta popolazione di cellule che includono inevitabilmente un numero significativo di neuroni sensori di glucosio. MPD di imaging is particolarmente utile per studiare i neuroni GI che sono più uniformemente localizzata nell&#39;intero VMH, fornendo così una popolazione adeguato allo studio nel VMH dissociato (~ 15% GI). Al contrario, mentre i neuroni GE sono densamente localizzate al ventrolateral-VMN e cella regione povera tra l&#39;ARC e VMN, non rappresentano un numero significativo di neuroni nel VMH (&lt;1% GE). Inoltre, studiando i neuroni isolati, astrociti e gli effetti presinaptici sono eliminati. Questo può essere un vantaggio nello studiare effetti primo ordine neurone, così come uno svantaggio in quanto le connessioni e processi fisiologici vengono persi. Un fattore limitante sia elettrofisiologia patch clamp e MPD / Imaging di calcio colorante è la necessità di utilizzare gli animali più piccoli (ad es. Topi o ratti &lt;8 settimane di età). Questo è principalmente dovuto all&#39;aumento del tessuto connettivo in combinazione con diminuita vitalità neuronale che si verifica con l&#39;età. Nel cervello-slice elettrofisiologia pernoi, aumento del tessuto connettivo rende più difficile visualizzare i neuroni. Tessuto connettivo aumentato rende anche più difficile dissociare un gran numero di neuroni sani per studi di imaging. Inoltre, i neuroni provenienti da animali più giovani sopravvivono più a lungo durante la registrazione patch clamp o immagini. Tuttavia, l&#39;uso di giovani mouse può essere una limitazione importante. Attività neuronale e / o risposte a neurotrasmettitori o sostanze nutritive circolanti cambiano con l&#39;età. Ad esempio, dal momento che il bilancio energetico è strettamente legata allo stato riproduttivo, i neuroni ipotalamici che regolano il bilancio energetico possono rispondere in modo diverso in pre-vs animali postpubescent. Inoltre, molte malattie richiedono un trattamento a lungo termine o non si manifestano fino all&#39;età adulta. Primi esempi di tali malattie sono l&#39;obesità o diabete di tipo 2 dieta. Dal momento che i neuroni sensibili al glucosio si ritiene di svolgere un ruolo in queste patologie abbiamo sviluppato una metodologia per la coltura di successo adulti sani VMH neuroni per l&#39;uso in immagini MPD experiments.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="947">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Neurobasal-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050128DJ</td>
			<td style="width:427px;">custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Hibernate-A Medium (Custom)</td>
			<td style="width:115px;">BrainBits</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>custom made glucose free</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">15140</td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Stericup vacuum filter units (0.22 &#956;m)</td>
			<td style="width:115px;">Millipore</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">25 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 25mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">18 mm Glass coverslips</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">#1 18mm round</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">GlutaMAX</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">35050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">B27 minus insulin (50x)</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;">0050129SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Razor blade</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:180px;">55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Vibratome &#38; cooling chamber</td>
			<td style="width:115px;">Vibratome</td>
			<td style="width:180px;">Series 1000 Sectioning system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences</td>
			<td style="width:180px;">22370</td>
			<td>injector or double edge blades from other vendors acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Papain, suspension</td>
			<td style="width:115px;">Worthington</td>
			<td style="width:180px;">LS003124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">BSA, suitable for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Sigma</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">DNAse, for cell culture</td>
			<td style="width:115px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">cloning cylinders, 6 mm x 8 mm</td>
			<td style="width:115px;">Bellco Glass</td>
			<td style="width:180px;">2090-00608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Membrane Potential Dye (blue)</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;">R8042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">In-line heater</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">SF-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Syringe pumps</td>
			<td style="width:115px;">WPI</td>
			<td style="width:180px;">sp100i</td>
			<td>other vendor acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Closed chamber</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">RC-43C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Polyethylene tubing</td>
			<td style="width:115px;">Warner</td>
			<td style="width:180px;">PE-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Metamorph</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td>alternate image analysis software acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:180px;">BX61 WI</td>
			<td>
			used with 10X&#160;objective
			</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Camera</td>
			<td style="width:115px;">Photometrics</td>
			<td style="width:180px;">Cool Snap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:225px;">Narrow Cy3 Filter Set</td>
			<td style="width:115px;">Chroma</td>
			<td style="width:180px;">41007a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:225px;">Illumination System</td>
			<td style="width:115px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:180px;">Lambda DG-4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

membrane potential dye imaging of ventromedial hypothalamus neurons from adult mice to study glucose sensing

Studi di attività neuronale vengono spesso eseguite utilizzando i neuroni di roditori meno di due mesi di età a causa delle difficoltà tecniche connesse con l&#39;aumento del tessuto connettivo e diminuiscono la vitalità neuronale che si verificano con l&#39;età. Qui, descriviamo una metodologia per la dissociazione di sano neuroni ipotalamici di topi adulti di età. La capacità di studiare i neuroni da topi adulti età consente l&#39;utilizzo di modelli di malattia che si manifesta in età più avanzata e potrebbe essere più evolutivamente accurato per alcuni studi. Imaging di fluorescenza dei neuroni dissociati può essere usato per studiare l&#39;attività di una popolazione di neuroni, anziché utilizzare elettrofisiologia per studiare un singolo neurone. Ciò è particolarmente utile quando si studia una popolazione eterogenea neuronale in cui il tipo neuronale desiderato è raro come per i neuroni ipotalamici glucosio sensing. Abbiamo utilizzato potenziale di membrana di imaging tintura di adulti neuroni ipotalamici ventromedial di studiare le loro risposte a chaNGES in glucosio extracellulare. Neuroni sensori del glucosio si ritiene di svolgere un ruolo centrale nella regolazione del bilancio energetico. La possibilità di studiare sensing del glucosio nei roditori adulti è particolarmente utile in quanto la prevalenza di malattie legate al bilancio energetico disfunzionale (ad es. Obesità) aumenta con l&#39;età.

La dissezione precisa del VMH lontano da altre aree ipotalamiche è importante ottenere risultati coerenti. L&#39;inclusione di altre aree potrebbe diluire la popolazione neuronale VMH, cambiando la% dei neuroni depolarizzati calcolati. Inoltre, neuroni sensori di glucosio sono stati identificati in altre regioni ipotalamici, quali l&#39;ipotalamo laterale, che possono differire funzionalmente e meccanicamente da VMH glucosio sensing neuroni. Figura 1 illustra le posizioni anatomiche corrette per una co...

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Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

L&#39;attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l&#39;utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.

Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell&#39;ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

membrane-potential-dye-imaging-ventromedial-hypothalamus-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  Rutgers New Jersey Medical School.  L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial. 

Video: Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

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Neuroscienze

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Determinazione della mitocondriale Oxygen Species potenziale di membrana e reattiva in neuroni corticali di ratto dal vivo

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Imaging pHluorin-tagged inserimento recettore alla membrana plasmatica nella Primaria neuroni mouse coltivate

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.