Preparare una diluizione di 12 millilitri di terreno di separazione al 60% e al 70% in provette coniche da 50 millilitri. Successivamente, preparare il gradiente dal basso verso l'alto aggiungendo quattro millilitri alla volta della diluizione al 60% rispetto alla diluizione del 70% utilizzando una pipetta da cinque millilitri. Quindi stratificare accuratamente 12 millilitri di sangue eparinizzato sopra il gradiente di densità e centrifugare a 200 G per 15 minuti a temperatura ambiente.
Scartare il plasma e gli strati di cellule mononucleate. Quindi trasferire con cautela circa 7,5 millilitri dello strato sopra il pellet eritrocitario in due tubi conici da 15 millilitri. Centrifugare le provette a 300 G per cinque minuti a 19 gradi Celsius.
Procedere al lavaggio del pellet cellulare con la soluzione salina bilanciata Hanks o HBSS. Quindi eseguire la lisi ipotonica e rimuovere i globuli rossi rimanenti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere delicatamente i neutrofili polimorfonucleati nel tampone rimanente e trasferirli in una provetta da microcentrifuga ghiacciata.
Successivamente, trasferire tre aliquote da un microlitro della sospensione cellulare su un vetrino pulito. Colorazione con panottica veloce per valutare la morfologia e la purezza cellulare. Osserva le cellule al microscopio e conta 300 cellule casuali in ogni pozzetto.
Contrassegnare i neutrofili e altri tipi di cellule per valutare la purezza della separazione. Successivamente, trasferire un microlitro della sospensione cellulare in 49 microlitri di colorante blu tripano allo 0,2% e contare le cellule morte e vitali utilizzando una camera di Neubauer. Regolare la concentrazione cellulare a 6.667 cellule per microlitro con il 50% di plasma autologo e il 50% di HBSS integrato con calcio e magnesio.
Quindi dividere uniformemente la sospensione cellulare tra provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri corrispondenti alle condizioni di test, compreso il controllo negativo. Preparare un sistema di attivazione per ogni condizione, assicurando che la concentrazione finale della cellula rimanga a 6.600 neutrofili polimorfonucleati per microlitro. Incubare a 37 gradi Celsius senza rotazione.
