Inizia sciogliendo 0,0005 grammi di NBT in 10 microlitri di DMSO. Dopo aver volato a vortice per 15 minuti, aggiungere 90 microlitri di soluzione salina bilanciata di Hank o HBSS con calcio e magnesio e un microlitro delle sostanze in esame. Ancora una volta, agitare il tubo per un massimo di due minuti.
Per eseguire il test del vetrino NBT, mescolare delicatamente e trasferire due microlitri dei neutrofili polimorfonucleati attivati precedentemente preparati su un vetrino pulito. Incubare il vetrino in camera umidificata a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Successivamente, aggiungere un microlitro della soluzione di lavoro NBT sulle celle.
Incubare nuovamente per 20 minuti, proteggendo dalla luce. Dopo aver asciugato il vetrino, fissarlo applicando una goccia di metanolo in ogni pozzetto per un minuto. Colorare il vetrino con 0,03 safranina per un altro minuto.
In ogni pozzetto, contare 100 cellule casuali, differenziando i neutrofili con e senza depositi di formazano. Per eseguire il saggio di spettrofotometria NBT, miscelare delicatamente e trasferire 90 microlitri dei neutrofili polimorfonucleati attivati precedentemente preparati in una provetta da microcentrifuga pulita. Quindi aggiungere con cura 20 microlitri di una soluzione NBT a sei millimolari e incubare la provetta al buio per 37 gradi Celsius per 20 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di SDS al 10% e Vortex. Sonicare con una punta sonicare al 60% di ampiezza, aggiungendo cinque cicli di 15 secondi ciascuno e intervalli di 15 secondi. Centrifugare a 12.000 g per cinque minuti.
Trasferire 60 microlitri di surnatante su una piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente e misurare l'assorbanza del prodotto surnatante a 570 nanometri. I risultati del test spettrofotometrico hanno indicato che 100 PMA nanomolari hanno indotto un'elevata produzione di ROS rispetto ai gruppi fMLP e di controllo. I risultati del test NBT hanno corroborato i risultati spettrofotometrici, mostrando che il PMA è lo stimolo che induce la produzione di ROS più intenso rispetto all'fMLP.
