Inizia normalizzando i campioni di proteine lacrimale umane a 50 microgrammi di proteine. Quindi aggiungere 200 millimolari di ditiotreitolo, o DTT, a una concentrazione finale di 20 millimolari DTT, incubati a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo aver raffreddato la soluzione proteica a temperatura ambiente, aggiungere 400 millimolari di iodoacetammide a una concentrazione finale di 40 millimolari, quindi incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti.
Successivamente, aggiungere il 12% di acido fosforico acquoso in un rapporto uno a 10, ottenendo una concentrazione finale dell'1,2%. Agitare brevemente la miscela per mescolare la soluzione. Aggiungere il tampone legante le proteine in un rapporto da uno a sei prima di eseguire nuovamente il vortex.
Aprire la colonna di microcentrifuga che intrappola la sospensione e assemblare la colonna di rotazione su una provetta per microcentrifuga da due millilitri per raccogliere il flusso. Aggiungere fino a 200 microlitri di miscela di lisato proteico acidificato nella colonna. Centrifugare la colonna a 4000 G per 20 secondi.
Successivamente, aggiungere 150 microlitri di tampone legante le proteine e centrifugare come prima per lavare la proteina in sospensione. Assemblare la microcolonna di intrappolamento della sospensione su una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere con cautela 20 microlitri di tampone di digestione TEAB sul filtro all'interno della colonna di centrifuga, evitando bolle e traferri d'aria.
Tappare saldamente la colonna di microrotazione che intrappola la sospensione per evitare l'evaporazione. Incubare a 47 gradi Celsius per un'ora in un miscelatore termico senza agitare. Peptidi eluiti con 40 microlitri di TEAB 50 millimolari.
Quindi centrifugare a 4000 G per 20 secondi. Ora aggiungere 40 microlitri di acido formico allo 0,2% e centrifugare come prima. Infine, aggiungere 35 microlitri di acido formico allo 0,2% e il 50% di acetonitrile prima di centrifugare nuovamente.
Estrarre i tre eluenti e asciugarli con una centrifuga sottovuoto. Una volta essiccati, conservare i campioni a 80 gradi Celsius per analisi future. La ricerca di acquisizione dipendente dai dati ha prodotto un totale di 1183 più o meno 118 proteine nel gruppo di intrappolamento in sospensione e 874 più o meno 70 proteine all'1% FDR nel gruppo in soluzione.
L'analisi dell'ontologia genica ha rivelato proteomi simili per entrambi gli approcci, con la funzione principale di attività catalitica di legame e regolazione della funzione molecolare.
