Questi protocolli sono progettati per massimizzare il recupero e la purezza delle proteine attraverso la precipitazione a base di solventi. Ti mostreremo un paio di trucchi per eseguire la precipitazione in fiale, oltre a un approccio semi-automatico in un formato di cartuccia di rotazione. Abbiamo anche ottimizzato il protocollo di precipitazione per essere coerente e veloce.
L'intero protocollo richiede solo pochi minuti. Questi protocolli dimostrano che la precipitazione con solvente delle proteine è ideale per la preparazione dei campioni prima della spettrometria di massa. I protocolli si adatteranno perfettamente ai flussi di lavoro professionali bottom-up e top down.
A dimostrarci oggi saranno Ziheng Dang e Victoria Miller, scienziato senior presso Proteoform Scientific ad Halifax, Nuova Scozia Pipettare 90 microlitri di soluzione proteica priva di particolato in una provetta da microcentrifuga in polipropilene. Quindi aggiungere 10 microlitri di una mole di cloruro di sodio acquoso e 400 microlitri di acetone nella soluzione del campione, tappare e picchiettare delicatamente la fiala per combinare i solventi. Lasciare che il flaconcino lo incubi.
A temperatura ambiente indisturbata per almeno due minuti dopo l'incubazione, centrifugare i campioni notando l'orientamento del flaconcino e centrifugare per un minimo di due minuti a 10.000 RCF o superiore a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, si osserva un pellet bianco visibile sul fondo del tubo. A questo punto, aprire il tubo e decantare il supernato in un contenitore per rifiuti invertendo il tubo.
Utilizzare un tovagliolo di carta per estrarre qualsiasi residuo di solvente dal flaconcino. Per SDS contenenti campioni. Erogare con cura 400 microlitri di acetone fresco senza disturbare il pellet.
Centrare immediatamente il campione per un minuto a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente posizionando il flaconcino nel rotore con lo stesso orientamento della rotazione iniziale. Contate il solvente di lavaggio come descritto in precedenza. Asciugare il campione con il tappo aperto per circa un minuto.
In una cappa aspirante, prima di una solubilizzazione del pellet. Erogare 100 microlitri della soluzione proteica in una fiala di polipropilene. Nella cappa aspirante, aggiungere 400 microlitri di metanolo seguiti da 100 microlitri di cloroformio.
Chiudere brevemente il flaconcino e il vortice per mescolare. Erogare rapidamente 300 microlitri di acqua direttamente al centro della fiala. Tappare il flaconcino e lasciarlo riposare indisturbato sul piano del banco per un minuto, dopo aver posto il flaconcino di polipropilene in una centrifuga e ruotarlo per cinque minuti a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente.
Si osserva che il flaconcino ha due strati di solvente e un pellet bianco visibile fino al flaconcino a circa 45 gradi. Rimuovere circa 700 microlitri di solvente dallo strato superiore ad una velocità uniforme utilizzando inizialmente una punta di micropipetta da un millilitro e successivamente con una punta di pipetta da 200 microlitri fino a formare una perlina nel flaconcino. Aggiungere 400 microlitri di metanolo fresco al flaconcino del campione senza disturbare il pellet erogando il solvente lungo il lato del flaconcino.
Tappare il flaconcino e unire gli strati di solvente dondolando delicatamente il flaconcino per far roteare i solventi insieme. Osservare il pellet di proteine bianche notando l'orientamento della fiala nella centrifuga a rotore per un minimo di 10 minuti a 10.000 volte G o superiore a temperatura ambiente. Inclinare il flaconcino con il pellet rivolto verso il basso.
Posizionare una punta di pipetta lungo il bordo superiore del flaconcino e rimuovere il surnatante con una punta di micropipetta da un millilitro a una velocità lenta ma uniforme. Trattenendo circa 20 microlitri di solvente. Lasciare asciugare il solvente residuo nella cappa aspirante.
Per precipitare la proteina. Utilizzando una cartuccia filtrante usa e getta, collegare la spina alla cartuccia filtrante superiore. Unire 90 microlitri di soluzione proteica 10 microlitri di una talpa aquas, cloruro di sodio e 400 microlitri di acetone.
Incubare per un minimo di due minuti sul piano del banco, centrifugare il campione proteico preparato con il tappo ancora collegato alla cartuccia di filtrazione per due minuti a 2, 500 volte G.At temperatura ambiente, capovolgere la cartuccia e svitare e rimuovere il tappo dalla base della cartuccia. Introdurre la cartuccia di filtrazione in un flaconcino pulito centrifugare il campione proteico per tre minuti a 500 volte G a temperatura ambiente. Eliminare il flusso attraverso il solvente dal flaconcino inferiore.
Lavare il pellet proteico aggiungendo 400 microlitri di acetone alla cartuccia di filtrazione, centrifugare per tre minuti a 500 volte G a temperatura ambiente o fino a quando non rimane alcun solvente nella cartuccia superiore. Seguendo i protocolli di precipitazione proteica precedentemente dimostrati. Risolubilizzare la proteina bagnando la membrana alla base della cartuccia di filtrazione erogando da due a cinque microlitri di propanolo ISO direttamente alla membrana immediatamente prima di procedere al protocollo di risolubilizzazione per la risolubilizzazione del pellet proteico preparare l'80% volume per volume soluzione di acido formico in acqua.
Pre-raffreddare questa soluzione acida a meno 20 gradi Celsius e la cartuccia di filtrazione contenente proteine precipitate. Erogare 50 microlitri di acido formico diluito a freddo nel tappo della cartuccia refrigerata e nel vortice per 30 secondi. Riportare la cartuccia filtrante nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti.
Ripeti i passaggi precedenti del vortice e dell'incubazione. Aggiungere 450 microlitri di acqua a un volume finale di 500 microlitri. Diluire l'acido formico all'8%Capovolgere la cartuccia svitando e rimuovendo il tappo dalla base della cartuccia e collegare la cartuccia SPE al flaconcino.
Far girare la proteina attraverso la cartuccia SPE in una centrifuga a temperatura ambiente per cinque minuti a 800 volte G.Se il solvente rimane nella cartuccia superiore, riportare la cartuccia nella centrifuga e ripetere la centrifuga. Risciacquare aggiungendo 300 microlitri di acetonitrile al 5% con lo 0,1% di TFA in acqua alla cartuccia SPE, far scorrere attraverso la cartuccia SPE per due minuti a 2000 volte G.Per proteine a basso peso molecolare o peptidi digeriti eluire il campione facendo scorrere 300 microlitri. Un acetonitrile al 50% con lo 0,1% di TFA per cinque minuti a 2.500 volte G.For proteine intatte.
Seguire con un'ulteriore fase di elusione utilizzando 300 microlitri di acetonitrile al 75% con acido ascetico trifluoro allo 0,1%. Combinare i due estratti risultanti. La figura confronta la deplezione di SDS dopo fiala o precipitazione di proteine in una cartuccia filtrante monouso.
Utilizzando acetone con i protocolli convenzionali rapid e CMW. Tutti gli approcci riducono la SDS per consentire un'analisi ottimale della spettrometria di massa. Questa figura mostra il recupero quantitativo delle proteine seguendo la rapida precipitazione dell'acetone e la precipitazione della CMW attraverso l'analisi della pagina SDS di un lisato cellulare totale di lievito trasformato.
Il recupero costante è stato ottenuto con tutti i protocolli di precipitazione. La precipitazione in una cartuccia di filtrazione usa e getta elimina la necessità di pipettare accuratamente SDS contenente surnatante mantenendo le proteine aggregate sopra un filtro a membrana. Quindi nessuna banda visibile è stata rilevata nelle frazioni di surnatante attraverso tre repliche indipendenti.
La precipitazione proteica a base di cartuccia dimostra un recupero superiore di un campione di plasma bovino digerito con pepsina rispetto alla precipitazione a base di flaconcino. Differenze più significative nella resa si notano nella cartuccia quando l'impiego di cloruro di sodio mentre l'impiego di solvente di zinco ha portato alla massima resa. Questa figura quantifica l'intensità di picco del peptide da ciascun campione di peptide con un rapporto superiore a uno che riflette una maggiore abbondanza di peptidi per i campioni trattati nelle cartucce filtranti monouso.
La figura confronta il numero di peptidi identificati per proteina tra i tre preparati campione replicati. I coefficienti di correlazione da 0,94 a 0,95 in questi grafici dimostrano l'elevata coerenza dell'approccio di preparazione del campione per l'analisi della spettrometria di massa bottom-up. Quindi, una volta formato quel pellet, vuoi davvero evitare di disturbarlo.
Se lo mantieni come pellet intatto otterrai una resa maggiore. Quindi assicurati di non dimenticare di lavare quel pellet con acetone extra. Questo ci sta assicurando che ci stiamo sbarazzando della SDS mantenendo il nostro campione il più pulito possibile e questo ci dà la migliore analisi di spettrometria di massa.
Quindi abbiamo scoperto che rimuovere il solvente in eccesso invertendo il è molto più semplice che cercare di pipettare il campione. In questo modo otterrai rendimenti più costanti. L'esecuzione della precipitazione dell'acetone a temperatura ambiente ha portato a un recupero più coerente e più rapido rispetto alla precipitazione tradizionale nel congelatore.
