Ringraziamo le scienze naturali e ingegneria Research Council (NSERC) e la Canadian Cancer Society per il sostegno finanziario. CSSC grazie NSERC e VNL ringrazia la Ontario Graduate Scholarship (OGS) programma per le borse di laurea. ARW ringrazia il CRC di un Canada Research Chair.

Parte 1: fabbricazione del dispositivo <ol><li> Substrati di vetro pulito in soluzione Piranha (3:1 conc acido solforico. Perossido di idrogeno 30%). Lasciare i substrati in soluzione Piranha per 10 minuti sotto agitazione. </li><li> Dopo il risciacquo in acqua deionizzata (DI) acqua e asciugare i substrati con N 2 gas, posizionare i substrati all&#39;interno della camera fascio di elettroni per la deposizione di cromo (spessore di 250 nm). </li><li> Per disidratare il cromata substrato, lavare in isopropanolo e poi cuocere su una piastra calda per 5 minuti a 115 ° C. </li><li> Asciugare i substrati e primo con esametildisilazano (HMDS) di spin-coating (30 s, 3000 rpm). Spin-coat nuovo (utilizzando parametri identici) con Shipley S1811 photoresist. </li><li> Pre-cuocere il substrato su piastra riscaldante (100 ° C, 2 min), poi modello il photoresist da esposizione a raggi ultravioletti (UV) irradiazione per 5 s attraverso un fotomaschere. </li><li> Sviluppare l&#39;UV-esposti substrati a Shipley MF 321 developer per 3 min e lavare in acqua deionizzata. Post-cuocere su una piastra a 100 ° C per 1 min. </li><li> Etch il cromo esposti immergendolo in cromo mordenzante per 30 secondi Sciacquare in acqua deionizzata, poi immergere in spogliarellista AZ300T per 10 minuti per rimuovere il photoresist rimanente. Sciacquare con acqua deionizzata e asciugare con N 2 gas. </li><li> Deposito 2-5 micron parylene-C (un polimero isolante) da vapore chimico deposizione su un substrato di cuscinetto fantasia cromo. Deposito del 50 nm di Teflon AF (per rendere la superficie idrofoba) da spin-coating una soluzione (1% peso / peso in Fluorinert FC-40) a 2000 rpm per 60 s. Post-cuocere sulla piastra riscaldante (160 ° C, 10 min). </li><li> Per formare la piastra superiore, cappotto una non-fantasia di ossido di indio e stagno (ITO) substrati di vetro di 50 nm Teflon AF, come sopra. </li><li> Post-cuocere entrambi i substrati su un piatto caldo (160 ° C, 10 min). </li></ol> Parte 2: Set-up del dispositivo e automazione <ol><li> In digitale dispositivi microfluidici utilizzato in configurazione &quot;due-plate&quot;, 1 gocce sono posizionate tra un substrato di fondo (con elettrodi di fantasia) e un substrato superiore (con un solo contigui, elettrodo trasparente, di solito formato da ITO). </li><li> Per impostare il dispositivo, rimuovere rivestimenti polimerici dal pad di contatto di un substrato di fondo da raschiare delicatamente con un bisturi. Coppia esposta pad del substrato inferiore a 40-pin (Figura 1a). </li><li> Potere-su un computer con LabView (National Instruments, Austin, TX), una casa costruita casella di controllo (con una serie di relè ad alta tensione che sono controllati da segnali da un National Instruments DAQPad), un generatore di funzioni, e un amplificatore . Il computer / controllo casella facilita il controllo dell&#39;utente su richiesta di 100 V RMS / 18 kHz, i segnali al dispositivo tramite il 40-pin. </li><li> Montare il dispositivo posizionando due pezzi di nastro biadesivo (140 micron di spessore totale) ai margini del supporto inferiore e completo di scivoli nanostrutturata ITO (piastra superiore). </li><li> Per inizializzare il sistema di controllo, eseguire il programma di calibrazione LabView (scritto in-house) per calibrare il controllo di feedback. </li><li> Caricare il campione e reagenti nelle cisterne appropriato (vedere paragrafo 3, sotto) e racchiudono sotto il substrato superiore (teflonato lato rivolto verso il basso). Collegare il connettore di terra al supporto superiore. </li><li> Caricare il codice di attivazione in LabView (scritto in-house) ed eseguire il programma per avviare attuazione delle gocce. </li></ol> Parte 3: preparazione dei campioni e reagenti <ol><li> Preparare tampone di lavoro (WB): 100 mm TrisHCl (pH 7,8) e 0,08% Pluronic F127 w / v. </li><li> Sciogliere proteina (s) da analizzare nel campione di WB e pipetta nel serbatoio 1 (R-1) del dispositivo, come mostrato nella figura 1b. </li><li> Preparare precipitante, acido tricloroacetico al 20% (TCA) in acqua deionizzata, e pipettare in R-2. </li><li> Preparare il tampone di lavaggio, 70/30 Cloroformio / acetonitrile (ACN) e pipettare in R-4. </li><li> Preparare tampone resolubilizing, 100 bicarbonato di ammonio mM (pH 8,0) e 0,08% Pluronic F127 w / v, e la pipetta in R-5. </li><li> Sciogliere riducente, tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), a 10 mm di WB e pipettare in R-6. </li><li> Sciogliere agente alchilante, Iodoacetamide (IAM), a 12 mm di WB e pipettare in R-7. </li><li> Sciogliere tripsina in WB ad una concentrazione pari a 1 / 5 della concentrazione del campione di proteine ​​totali (vedi 3.1, sopra) e pipettare in R-8. </li></ol> Parte 4: elaborazione digitale del campione Microfluidic <ol><li> La seguente procedura è attuata automaticamente per mezzo di codice scritto in LabView-casa. Il volume di gocce dispensato dai serbatoi è definita dalle dimensioni degli elettrodi (in questo caso, le gocce sono dispensati ~ 600nL). </li><li> Dispensare una goccia di proteine ​​contenenti campioni da R-1 e una goccia di precipitante da R-2 (Figura 2, fotogramma 1). Unire le due gocce e consentire la goccia combinati per incubare per 5 minuti, con la conseguente precipitazione di proteins sulla superficie (Figura 2, Cornici 2-3). Azionare il surnatante dalla proteina precipitata al serbatoio di rifiuti, R-3 (Figura 2, Frame 4). </li><li> Erogare tre gocce di tampone di lavaggio da R-4 e guidarli attraverso la proteina precipitata al serbatoio di rifiuti, R-3 (Figura 2, Frame 5). </li><li> Lasciare asciugare il precipitato, e dispensare una goccia di tampone resolubilizing da R-5 alla proteina. Lasciare che il buffer per incubare per 20 minuti fino a quando il precipitato si è sciolta (Figura 2, Frame 6). </li><li> Dispensare una goccia di riducente da R-6 e si fondono con la goccia del campione. Mescolare la goccia combinato azionando che in 6 elettrodi in uno schema circolare. Lasciare la goccia di incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata (Figura 3, Cornici 1-2). </li><li> Dispensare una goccia di agenti alchilanti da R-7 e si fondono con la goccia del campione, seguita da miscelazione (come in 4.5). Lasciare la goccia di incubare per 15 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata, al riparo dalla luce (Figura 3, Cornici 2-3). </li><li> Dispensare una goccia di tripsina da R-8, e si fondono con la goccia del campione, seguita da miscelazione (come in 4.5). Lasciare la goccia di incubare per 3 ore a 37 ° C in una camera umidificata su una piastra riscaldante (Figura 3, Cornici 3-4). </li></ol> Parte 5: Post-Processing preparazione dei campioni <ol><li> Rimuovere il supporto superiore e la digestione reazione estinguere con l&#39;aggiunta di 0.6 ml di acido trifluoroacetico 2,5% in acqua. </li><li> Purificare prodotto spento reazione utilizzando ZipTips C18 (Millipore, Billerica, MA) in base alle istruzioni del produttore. </li><li> Diluire purificata campione in acqua deionizzata per un volume finale di 100 mL. </li></ol> Parte 6: Spettrometria di Massa <ol><li> Valutare il campione elaborato su un nano-HPLC accoppiato ad uno spettrometro di massa tandem. Il sistema HPLC utilizzato qui è da Technologies Eksigent ed è dotato di una colonna trappola (3 mm di diametro. Perle di C18, 150 ID micron x 2,5 cm) e una fase inversa colonna di separazione (3 diametro di micron. Perle di C18, 75 micron x ID 15 cm). Lo spettrometro di massa qui è un LTQ di Thermo Fisher Scientific-. </li><li> Caricare un campione di 2 microlitri nella colonna trappola a 5μL/min in una fase mobile composta da 5% di acetonitrile in acqua. Separare il campione sulla colonna in fase inversa a 0.5μL/min utilizzando un gradiente lineare dal 20% acetonitrile acetonitrile al 80% per 25 min. Continua l&#39;esecuzione a 80% acetonitrile per altri 10 min. </li><li> Analizzare le bande eluizione di fuori della colonna mediante spettrometria di massa tandem. Nel lavoro qui riportato, l&#39;eluente viene campionato in spettrometro di massa tramite un emettitore nanoelectrospray (20 micron ID ID ridotto gradualmente a 10 micron) da NewObjective. </li><li> Identificare le proteine ​​nel campione utilizzando un programma di ricerca nel database come SEQUEST. In questo lavoro, abbiamo utilizzato la versione di SEQUEST incorporato nel Bioworks v3.01 (Thermo Fisher Scientific-), e le proteine ​​identificate probabilità avevano un punteggio inferiore a 1.0E-03 (pari al 99,9% intervallo di confidenza), e la sequenza delle coperture a almeno il 30% (Figura 4). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1a.jpg" align="Figure 1a" /> <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig1b.jpg" align="Figure 1b" /> Figura 1. (A) Una foto di un dispositivo accoppiato DMF a 40-pin per l&#39;attivazione automatica delle gocce. (B) Una schematica di un dispositivo che rappresenta il posizionamento del campione e reagenti necessari per un workup proteomica. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig2.jpg" align="Figure 2" /> Cornici Figura 2. Da un film che rappresenta l&#39;estrazione automatica e la purificazione di BSA nel 20% TCA (precipitante) e acetonitrile 70/30% cloroformio / (soluzione di risciacquo). Nel frame 6, la proteina è precipitata ridisciolto in una goccia di 100 mM di bicarbonato di ammonio. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig3.jpg" align="Figure 3" /> Figura 3. Fotogrammi da un filmato che illustra riduzione sequenziale, alchilazione, e la digestione di una goccia di proteine ​​resolubilized. In questa figura, i reagenti sono colorati con coloranti per chiarezza, in pratica, i reagenti non sono colorati. <img src="/files/ftp_upload/1603/1603fig4.jpg" align="Figure 4" /> Figura 4. Cromatogramma MS di un campione di albumina sierica bovina trattati da microfluidica digitale. 25 peptidi distinti sono stati identificati (99,9% intervallo di confidenza) corrispondente sequenza una copertura del 44%.

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	<li>Abdelgawad, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Digital+Revolution:+A+New+Paradigm+for+Microfluidics.">The Digital Revolution: A New Paradigm for Microfluidics.</a> Adv. Mat. 21, 920-925 (2009).</li><li>Jebrail, M., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Method+for+Protein+Extraction+by+Precipitation.">A Digital Microfluidic Method for Protein Extraction by Precipitation.</a> Anal. Chem. 81, 330-335 (2009).</li><li>Luk, V. N., Wheeler, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Digital+Microfluidic+Approach+to+Proteomic+Sample+Processing.">A Digital Microfluidic Approach to Proteomic Sample Processing.</a> Anal. Chem. 81, 4524-4530 (2009).</li></ol>

La mancanza di manipolazione del campione standardizzati e l&#39;elaborazione di proteomica è una limitazione importante per il campo. Inoltre, convenzionali di gestione dei campioni macroscala coinvolge più contenitori e trasferimenti soluzione, che può portare a perdita di campione e la contaminazione. Una possibile soluzione a questi problemi è quello di formare sistemi integrati per l&#39;elaborazione del campione affidamento su digitale microfluidica 1 (DMF). Nel precedente lavoro, DMF ha dimostrato ...

digital microfluidics for automated proteomic processing

Proteomica clinica è emerso come una disciplina nuova e importante, promettendo la scoperta di biomarcatori che saranno utili per la diagnosi precoce e la prognosi della malattia. Mentre i metodi di proteomica clinica variano ampiamente, una caratteristica comune è la necessità di (i) l&#39;estrazione di proteine ​​da fluidi estremamente eterogenei (ad esempio siero, sangue intero, ecc) e (ii) la trasformazione biochimica vasta prima dell&#39;analisi. Qui riportiamo un nuovo microfluidica digitale (DMF) metodo basato integrando diverse fasi di lavorazione utilizzate in proteomica clinica. Questo comprende l&#39;estrazione di proteine, resolubilization, riduzione, alchilazione e digestione enzimatica. Microfluidica digitale è un fluido microscala gestione tecnica in cui vengono manipolate le goccioline nanoliter-microlitro dimensioni su una superficie aperta. Le goccioline sono posizionati sulla parte superiore di un array di elettrodi che sono rivestite da uno strato dielettrico - quando un potenziale elettrico viene applicato la goccia, le spese si accumulano su entrambi i lati del dielettrico. Le accuse fungono da maniglie elettrostatiche che possono essere utilizzati per controllare la posizione delle gocce, e da una sequenza di polarizzazione di elettrodi in serie, le gocce possono essere fatte fare a meno, spostare, unire, miscelare, e dividere in superficie. Pertanto, DMF è una scelta naturale per il trasporto rapido, sequenziale, multistep, miniaturizzati test automatizzati biochimici. Questo rappresenta un significativo passo avanti rispetto ai metodi tradizionali (affidamento su pipettaggio manuale o robot), e ha il potenziale per essere un utile strumento nuovo in proteomica clinica. Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, e Steve CC Shih contribuito in maniera uguale a questo lavoro. Indirizzo attuale Sergio LS Freire è presso l&#39;Università delle Scienze di Filadelfia situato a 600 South 43 Street, Philadelphia, PA 19104.

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Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Microfluidica digitale è una tecnica caratterizzata dalla manipolazione di goccioline discreti (~ nL - ml) su una serie di elettrodi con l&#39;applicazione di campi elettrici. E &#39;adatto per lo svolgimento rapido, sequenziale, miniaturizzati test automatizzati biochimici. Qui riportiamo una piattaforma in grado di automatizzare diverse fasi di lavorazione proteomica.

Microfluidica digitale per trattamento automatizzato di proteomica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

digital-microfluidics-for-automated-proteomic-processing

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K Views.  University of Toronto. Microfluidica digitale è una tecnica caratterizzata dalla manipolazione di goccioline discreti (~ nL - ml) su una serie di elettrodi con l'applicazione di campi elettrici. E 'adatto per lo svolgimento rapido, sequenziale, miniaturizzati test automatizzati biochimici. Qui riportiamo una piattaforma in grado di automatizzare diverse fasi di lavorazione proteomica.

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Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and biogeochemical flux. However, to take advantage of nutrient patches in the ocean, swimming microbes must overcome the influences of physical forces including molecular diffusion and turbulent shear, which will limit the availability of patches and the ability of bacteria to locate them. Until recently, methodological limitations have precluded direct examinations of microbial behaviour within patchy habitats and realistic small-scale flow conditions. Hence, much of our current knowledge regarding microbial behaviour in the ocean has been procured from theoretical predictions. To obtain new information on microbial foraging behaviour in the ocean we have applied soft lithographic fabrication techniques to develop 2 microfluidic devices, which we have used to create (i) microscale nutrient patches with dimensions and diffusive characteristics relevant to oceanic processes and (ii) microscale vortices, with shear rates corresponding to those expected in the ocean. These microfluidic devices have permitted a first direct examination of microbial swimming and chemotactic behaviour within a heterogeneous and dynamic seascape. The combined use of epifluorescence and phase contrast microscopy allow direct examinations of the physical dimensions and diffusive characteristics of nutrient patches, while observing the population-level aggregative response, in addition to the swimming behaviour of individual microbes. These experiments have revealed that some species of phytoplankton, heterotrophic bacteria and phagotrophic protists are adept at locating and exploiting diffusing microscale resource patches within very short time frames. We have also shown that up to moderate shear rates, marine bacteria are able to  fight the flow  and swim through their environment at their own accord. However, beyond a threshold high shear level, bacteria are aligned in the shear flow and are less capable of swimming without disturbance from the flow. Microfluidics represents a novel and inexpensive approach for studying aquatic microbial ecology, and due to its suitability for accurately creating realistic flow fields and substrate gradients at the microscale, is ideally applicable to examinations of microbial behaviour at the smallest scales of interaction.  We therefore suggest that microfluidics represents a valuable tool for obtaining a better understanding of the ecology of microorganisms in the ocean.

The fabrication of microfluidic channels and their implementation in experiments for studying the chemotactic foraging behaviour of marine microbes within a patchy nutrient seascape and the swimming behaviour of bacteria within shear flow are described.

Risposta chemiotattica di microrganismi marini a livelli di nutrienti Micro-Scale

The degree to which planktonic microbes can exploit microscale resource patches will have considerable implications for oceanic trophodynamics and ...

Ricerca

Biologia

Studies of Bacterial Chemotaxis Using Microfluidics - Interview

Gli studi di chemiotassi batterica Utilizzando Microfluidica - Intervista

Applying Microfluidics to Electrophysiology

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the microfluidic brain slice device is discussed including how the device docks to standard perfusion chambers and the technique of passive pumping which is used to deliver boluses of neuromodulators to the brain slice.  By simplifying the device design, we are able to achieve a practical solution to the current unmet electrophysiology need of applying multiple neuromodulators across multiple regions of the brain slice.  This is achieved by substituting the standard coverglass substrate of the perfusion chamber with a thin microfluidic device bonded to the coverglass substrate.  This was then attached to the perfusion chamber and small holes connect the open-well of the perfusion chamber to the microfluidic channels buried within the microfluidic substrate.  These microfluidic channels are interfaced with ports drilled into the edge of the perfusion chamber to access and deliver stimulants.  This project represents how the field of microfluidics is transitioning away from proof-of concept device demonstrations and into practical solutions for unmet experimental and clinical needs.

Applicando Microfluidica di Elettrofisiologia

Microfluidics can be integrated with standard electrophysiology techniques to allow new experimental modalities.  Specifically, the motivation for the ...

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Sviluppo di nuove applicazioni terapeutiche Utilizzando Microfluidica

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Immunoblot Analysis

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. It involves the solubilization and electrophoretic separation of proteins, glycoproteins, or lipopolysaccharides by gel electrophoresis, followed by quantitative transfer and irreversible binding to nitrocellulose, PVDF, or nylon. The immunoblotting technique has been useful in identifying specific antigens recognized by polyclonal or monoclonal antibodies and is highly sensitive (1 ng of antigen can be detected). This unit provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the specificity inherent in antigen-antibody recognition. This video provides protocols for protein separation, blotting proteins onto membranes, immunoprobing, and visualization using chromogenic or chemiluminescent substrates.

Analisi immunoblot

Immunoblotting (western blotting) is a rapid and sensitive assay for the detection and characterization of proteins that works by exploiting the ...

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Colorazione proteine ​​in gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, moniliformin, etc... have adverse effects on both human and animal health and some are considered as pathogenicity factors. Proteomic studies showed to be effective for deciphering toxin production mechanisms (Taylor et al., 2008) as well as for identifying potential pathogenic factors (Paper et al., 2007, Houterman et al., 2007) in Fusaria. It becomes therefore fundamental to establish reliable methods for comparing between proteomic studies in order to rely on true differences found in protein expression among experiments, strains and laboratories. The procedure that will be described should contribute to an increased level of standardization of proteomic procedures by two ways. The filmed protocol is used to increase the level of details that can be described precisely. Moreover, the availability of standardized procedures to process biological replicates should guarantee a higher robustness of data, taking into account also the human factor within the technical reproducibility of the extraction procedure.
The protocol described requires 16 days for its completion: fourteen days for cultures and two days for protein extraction (figure 1). 
Briefly, Fusarium strains are grown on solid media for 4 days; they are then manually fragmented and transferred into a modified toxin inducing media (Jiao et al., 2008) for 10 days. Mycelium is collected by filtration through a Miracloth layer. Grinding is performed in a cold chamber. Different operators performed extraction replicates (n=3) in order to take into account the bias due to technical variations (figure 2). Extraction was based on a SDS/DTT buffer as described in Taylor et al. (2008) with slight modifications. Total protein extraction required a precipitation process of the proteins using Aceton/TCA/DTT buffer overnight and Acetone /DTT washing (figure 3a,3b). Proteins were finally resolubilized in the protein-labelling buffer and quantified. Results of the extraction were visualized on a 1D gel (Figure 4, SDS-PAGE), before proceeding to 2D gels (IEF/SDS-PAGE). The same procedure can be applied for proteomic analyses on other growing media and other filamentous fungi (Miles et al., 2007).

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Protein extraction for proteomic analyses in fungal species requires high levels of standardization to be accomplished according with the minimum information about a proteomic experiment (MIAPE) guidelines. We present a video-protocol that includes a procedure for minimizing experimental bias during toxin induction and protein extraction from Fusarium spp.

Tossina induzione ed estrazione di proteine ​​da Fusarium Spp. Culture per studi di proteomica

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Evisceration of Mouse Vitreous and Retina for Proteomic Analyses

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is a highly aqueous extracellular matrix overlying the retina where intraocular as well as extraocular proteins accumulate during disease.1-3 Abnormal interactions between vitreous and retina underlie several diseases such as retinal detachment, proliferative diabetic retinopathy, uveitis, and proliferative vitreoretinopathy.1,4 The relative mouse vitreous volume is significantly smaller than the human vitreous (Figure 1), since the mouse lens occupies nearly 75% of its eye.5 This has made biochemical studies of mouse vitreous challenging. In this video article, we present a technique to dissect and isolate the mouse vitreous from the retina, which will allow use of transgenic mouse models to more clearly define the role of this extracellular matrix in the development of vitreoretinal diseases.

The dissection technique illustrates evisceration of the vitreous, retina, and lens from the mouse eye, separation by centrifugation, and characterization with protein assays.

Eviscerazione delle Vitreous Mouse e Retina per analisi proteomica

While the mouse retina has emerged as an important genetic model for inherited retinal disease, the mouse vitreous remains to be explored. The vitreous is ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Metabolic Etichettatura e con membrana frazionamento per proteomica comparativa Analisi del<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culture sospensione cellulare

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...