Per iniziare, prendi 500 microlitri della soluzione PBS/BEV preparata. Combinalo con tre millilitri di PBS e mescola delicatamente usando una pipetta da 1.000 microlitri. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 millilitri su una piastra di schiuma forata ed etichettare la provetta con una freccia verso il basso.
Quindi tenere una pipetta da 1.000 microlitri verticalmente e aggiungere tre millilitri di soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta. Posizionare un supporto per tubo leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma sotto l'apertura del tubo e inclinare il tubo a un angolo di 70 gradi. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere tre millilitri di soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo al 50%.
Quindi stratificare tre millilitri di soluzione di iodixanolo al 20% sulla soluzione di iodixanolo al 40%. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere tre millilitri di una soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% preparata. Quindi, aggiungere 3,5 millilitri di soluzione PBS/BEV sopra la soluzione di iodixanolo al 10% e riportare delicatamente le provette in posizione verticale.
Ora, posiziona una provetta per ultracentrifuga da 31 millilitri su una piastra di schiuma con fori ed etichettala con una freccia verso l'alto. Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere verticalmente 2,5 millilitri della soluzione madre di iodixanolo al 60% sul fondo della provetta e combinarla con 500 microlitri di soluzione PBS/BEV per ottenere tre millilitri di soluzione BEV al 50% di iodixanolo. Miscelare accuratamente la soluzione mediante pipettaggio.
Quindi, dopo aver stratificato la soluzione di iodixanolo al 40, 20 e 10% in sequenza, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 3,5 millilitri di PBS sopra la soluzione di iodixanolo al 10%. Regolare il peso dei due tubi con PBS su un peso totale compreso tra più meno 0.005 grammi. Quindi, posizionare le provette nei secchi e centrifugarle a 160.000 G per sette ore a quattro gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta, raccogliere le frazioni ottenute da una modalità di ultracentrifugazione a gradiente in sequenza dall'alto verso il basso contro la parete laterale in 10 provette separate da 38,5 millilitri per ultracentrifuga. Quindi ultracentrifugare le frazioni a 160.000 g per 70 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante e capovolgere le provette dell'ultracentrifuga per cinque minuti.
Successivamente, risospendere i pellet in 200 microlitri di PBS pre-raffreddato utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Trasferire la soluzione PBS/BEV in una microprovetta pulita da 1,5 millilitri. Etichettare le frazioni da F1 a F10 come ottenute da una modalità di ultracentrifugazione a gradiente e procedere con l'analisi.
