Questa procedura ha affrontato la necessità di una raccolta di vescicole extracellulari derivate da cellule staminali mesenchimali semplici e affidabili e di applicazione nella traduzione della ricerca. La raccolta di vescicole extracellulari mediante centrifugazione differenziale è semplice, facilmente scalabile e riproducibile, il che sarà utile al campo. Le vescicole extracellulari indistinte dalle cellule staminali mesenchimali indistinte sono un'applicazione indistinta nei moderni trattamenti delle malattie.
Non avrò paura degli errori. Questa operazione è semplice e facile da imparare. Ci sono molti dettagli in questo semplice programma che possono essere presentati meglio attraverso il video.
Per iniziare, coltivare le cellule staminali mesenchimali a oltre il 90% di confluenza. Sostituire il terreno di coltura in ogni piatto con 8 ml di alfa-MEM integrato. Dopo 48 ore di coltura, le cellule devono essere coltivate uniformemente per raccogliere completamente il terreno di coltura in provette da centrifuga da 50 ml.
Quindi, centrifugare il terreno di coltura a 800 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in tubi conici da 1,5 mL per rimuovere i frammenti cellulari e i detriti cellulari. Centrifugare il surnatante a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Utilizzare una pipetta per trasferire la sospensione in tubi ultracentrifuga. Quindi, centrifugare a 150.000 x g per due ore a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet di microvescicole in 50 uL di PBS per piatto.
Scartare il surnatante e raccogliere il residuo, che è esosomi. Risospendere gli esosomi da sette piatti di cellule in 50 uL di PBS. In un tubo da 15 ml, diluire 1 uL di vescicole extracellulari in 1.499 uL di PBS e mescolare.
Quindi, avviare il software compatibile per l'analizzatore di tracciamento. Riempire la cella del campione con acqua distillata e quindi consentire allo strumento di avviare il controllo della cella. Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata.
Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia compreso tra 50 e 400, preferibilmente circa 200, e fare clic su OK. Quindi, sciacquare la cella del campione con 5 ml di acqua distillata. Prima dell'analisi del campione, lavare il canale con 1 mL di acqua distillata.
Assicurarsi che il numero di particelle visualizzato sull'interfaccia di rilevamento del software sia inferiore a 10. In un tubo conico da 1,5 ml, risospendere le vescicole extracellulari con 250 uL di PBS. In un altro tubo conico da 1,5 ml, preparare la soluzione di lavoro del colorante PKH26.
Mescolare le vescicole extracellulari risospese con la soluzione di lavoro. Lasciare riposare a temperatura ambiente per cinque minuti e quindi aggiungere 500 uL di FBS impoverito di EV per fermare la reazione. Per le microvescicole, centrifugare a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di PBS per risciacquare il residuo. Centrifugare di nuovo e scartare il surnatante per rimuovere il colorante non legato.
Per le microvescicole, centrifugare a 16.000 x g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il residuo con 200 uL di PBS. Far cadere 20 uL di sospensione sul vetrino e osservarlo al microscopio a fluorescenza.
Risospendere le vescicole extracellulari in 200 uL di PBS, quindi mescolare con soluzione di eparina in un rapporto di volume 10: 1. Posizionare il mouse nel sistema di imaging della vena caudale. Premere l'interruttore per sollevare la leva.
Con l'aiuto di un illustratore di vene della coda, eseguire un'iniezione sistematica della sospensione della vescicola extracellulare attraverso la vena della coda. L'analisi della distribuzione granulometrica utilizzando NTA ha dimostrato che la dimensione degli esosomi delle cellule staminali mesenchimali umane variava da 40 a 335 nm, con una dimensione di picco di circa 100 nm. Inoltre, la dimensione delle microvescicole variava da 50 a 445 nm, con una dimensione di picco di 150 nm.
La caratterizzazione morfologica degli esosomi ha mostrato che esibivano una tipica forma a coppa. Le vescicole extracellulari sono state etichettate in modo efficiente da PKH26, che è stato osservato dalla vista grossolana come pellet marcati, nonché dalla microscopia fluorescente. L'operatore deve prestare attenzione durante la raccolta del surnatante perché le cellule devono essere soffiate uniformemente per raccogliere completamente le EV rilasciate trattenute nell'indistinguibile delle cellule staminali mesenchimali.
Al fine di verificare il successo dell'iniezione, è possibile eseguire l'imaging in vivo della biodistribuzione di EV marcate con fluorescenza o sezioni congelate di specifici siti tissutali di attecchimento.
