Questo protocollo ci consente di utilizzare un numero ridotto di zecche che riduce il costo del mantenimento della colonia e diminuisce il numero di animali vertebra necessari per l'alimentazione delle zecche. Questo protocollo richiede circa 20 zecche. Tuttavia, il vantaggio principale oltre all'utilizzo di un campione di piccole dimensioni è che questo protocollo può essere applicato a più specie di zecche e diverse fasi di vita.
Oltre alle dissezioni delle zecche o all'applicazione verso le interazioni ospite-parassita, l'effetto dell'infezione patogena sulla secrezione di microRNA e l'effetto dei cambiamenti fisiologici sui microRNA secreti dalle zecche. Per iniziare, preparare terreni privi di vescicola aggiungendo siero bovino fetale, brodo di triptosio fosfato, concentrato di colesterolo lipoproteico al 10%, bicarbonato di sodio al 5%, HEPES e terreno L15C300 in un flacone di centrifuga in policarbonato da 26,3 millilitri e regolare il volume secondo necessità. Ora ultracentrifugare il mezzo a 100.000 volte G a quattro gradi Celsius per 18 ore.
Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet e trasferire il surnatante in una provetta da centrifuga fresca. Ultracentrifugare ancora una volta il tubo. Prendi il surnatante e passalo attraverso un filtro da 0,22 micrometri per rimuovere i contaminanti.
Pipettare il surnatante in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e conservarlo a meno 20 gradi Celsius fino a quando necessario o fino a tre anni. Aggiungere una quantità appropriata di antibiotici a 500 microlitri del mezzo privo di vescicola in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti. Ora, aggiungere PBS con rifampicina ai pozzetti che non contengono terreno privo di vescicola per prevenire la crescita batterica.
Posizionare le zecche su un vetrino con nastro biadesivo sotto un microscopio da dissezione. Prima della dissezione, aggiungere PBS contenente rifampicina al segno di spunta e utilizzando forbici Vannas da quattro millimetri, praticare un'incisione di circa un millimetro sul lato di ciascuna femmina. Ora, rimuovere il lato dorsale della zecca e le ghiandole salivari, quindi mettere da 20 a 40 ghiandole salivari da zecca in 500 microlitri di mezzo privo di vescicola aggiunto a un singolo pozzetto in una piastra trattata con coltura tissutale a 24 pozzetti.
Incubare i campioni delle ghiandole salivari a 32 gradi Celsius per 24 ore per consentire la secrezione delle vescicole extracellulari. Alla fine dell'incubazione, pipettare tutto il mezzo contenente le ghiandole salivari in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 300 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Risospendere il pellet contenente le ghiandole salivari nell'RNA in seguito e conservare a meno 80 gradi Celsius fino all'uso o indefinitamente. Ora, rimuovere i detriti cellulari centrifugando il surnatante a 2.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti e pipettare il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, centrifugare a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i corpi apoptotici e le vescicole extracellulari più grandi e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Quindi assemblare un filtro a siringa in nylon da un micrometro su una siringa da 10 millilitri e tenerlo su un tubo ultracentrifugo. Quindi aggiungere il campione e riempire la siringa con 10 millilitri di PBS. Passare il surnatante attraverso il filtro nel tubo.
Dopo aver filtrato e bilanciato i tubi, posizionarli in un rotore da 70 Ti e ultracentrifugare i tubi a 100.000 volte G per 18 ore a quattro gradi Celsius. Le vescicole extracellulari concentrate formano un pellet dopo l'ultracentrifugazione. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in PBS.
Pipettare 500 microlitri della vescicola extracellulare in un filtro centrifugo da 300 K e centrifugare a 8.000 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente e ripetere questa procedura fino a filtrare tutte le vescicole extracellulari. Infine, aggiungere 400 microlitri di PBS sterilizzato alla colonna e mescolare accuratamente per rimuovere le vescicole extracellulari attaccate alla membrana. Quindi mettere il campione in una provetta libera da DNAasi RNAsi da 1,5 millilitri.
La concentrazione e la dimensione delle vescicole extracellulari variavano a seconda del sesso e della fase di vita delle zecche tra le repliche biologiche per femmine, maschi e ninfe. Per tutte le repliche biologiche combinate, sono stati osservati risultati simili. L'analisi di piccoli RNA isolati dalla ghiandola salivare ha mostrato bande corrispondenti all'RNA ribosomiale e ai microRNA.
Tuttavia, gli RNA ribosomiali erano assenti nelle vescicole isolate dalle ghiandole salivari e i campioni di microRNA purificati dalle vescicole extracellulari mostravano una maggiore degradazione. Dopo l'arricchimento, i campioni di microRNA purificati dalle EV hanno mostrato una degradazione minima e una concentrazione sufficiente di microRNA per la sintesi della libreria di cDNA. La dimensione della banda prevista di circa 150 coppie di basi dopo la preparazione della libreria di cDNA è stata ottenuta indica piccole librerie di cDNA di RNA.
Durante la preparazione senza vescicola, assicurarsi di seguire i passaggi per prevenire la contaminazione delle vescicole esterne. Durante la preparazione della piastra del pozzo, assicurarsi di aggiungere antibiotici per prevenire la contaminazione batterica dal microbioma delle zecche. I microRNA estratti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per la profilazione e gli esperimenti funzionali per convalidare i ruoli dei microRNA come la previsione di bersagli del pathway dei microRNA, l'inibizione e gli esperimenti di mimetismo.
