Questo protocollo fornisce un modo fattibile per isolare e raccogliere le giuste vescicole extracellulari dalla maggior parte del sangue e dei tessuti solidi, in particolare analizzare la loro fonte e il contenuto proteico, il che aiuta ulteriori esperimenti funzionali. Oltre all'alta resa e alla bassa contaminazione, il principale vantaggio di questo protocollo è l'analisi degli antigeni di superficie e dei carichi proteici delle EV, utile per studi fisiologici e patologici. Facilita la diagnosi di tumori di malattie, come le malattie infiammatorie e l'osteoporosi attraverso la rilevazione di marcatori di superficie delle cellule parentali delle vescicole extracellulari con un citometro a flusso.
La quantità di vescicola extracellulare tissutale è fondamentale per i seguenti esperimenti. Assicurati che la concentrazione di vescicole extracellulari non sia elevata. Sii paziente per eseguire la diluizione.
Per iniziare, preparare i campioni di osso mascellare isolando l'osso mascellare con pinzette oftalmiche e forbici e lavarli con PBS per eliminare i tessuti molli con una pinzetta. Quindi mettere l'osso mascellare in provette da centrifuga da 1,5 millilitri e tagliare l'osso in piccoli pezzi di un millimetro di diametro con le forbici. Aggiungere una certa quantità di Liberase per coprire il tessuto e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Quindi, centrifugare il campione a 800 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire con attenzione il surnatante con una pipetta in una nuova e pulita provette da centrifuga da 1,5 millilitri. Dopo aver centrifugato i campioni di plasma e ossa preparati per 15 minuti a 2.500 G e quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti di grandi cellule e le piastrine rimanenti, trasferire con attenzione i surnatanti in provette da centrifuga da 1,5 millilitri nuove e pulite e centrifugare a 16.800 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, scartare il surnatante e risospendere i pellet in ciascun tubo con un millilitro di PBS.
Dopo aver centrifugato e scartato il surnatante come dimostrato in precedenza, di nuovo, risospendere i pellet in ogni tubo con 50 microlitri di PBS e conservare questi campioni a quattro gradi Celsius per meno di 24 ore o preferibilmente utilizzarli immediatamente per le analisi. Risospendere i campioni con 500 microlitri di PBS e trasferire 50 microlitri in un nuovo e pulito tubo da centrifuga da 1,5 millilitri come controllo in bianco etichettato come tubo A e altri 50 microlitri in un altro tubo di centrifuga pulito da 1,5 millilitri come semplice tubo di colorazione per FITC, etichettato come tubo B.Aggiungere 0,5 microlitri di colorante di membrana al tubo primario per la colorazione della membrana durante l'incubazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato il tubo primario per 30 minuti a 16.800 G e scartato il surnatante, risospendere il pellet con 200 microlitri di PBS.
Dividere ogni campione da 50 microlitri in quattro provette da centrifuga da 1,5 millilitri per semplici provette di colorazione per PE etichettato come tubo C, colorazione marcatore di superficie etichettata come tubo D e controlli secondari solo anticorpali etichettati come tubo E.Aggiungere separatamente l'anticorpo primario del recettore associato agli osteoclasti e dei campioni di vescicole extracellulari ossee, nonché i campioni di anticorpi CD-18 e vescicole extracellulari plasmatiche al tubo B e al tubo D, separatamente, incubazione per un'ora a quattro gradi Celsius. Centrifugare i tubi e scartare il surnatante come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet con 500 microlitri di PBS. Di nuovo, centrifugare per 30 minuti a 16, 800 G e quattro gradi Celsius per rimuovere gli anticorpi primari extra.
Dopo aver scartato il surnatante risospendere i pellet con 50 microlitri di PBS, seguiti dall'aggiunta di anticorpi secondari coniugati FITC rispettivamente nel tubo E.Incubare tutti i tubi per un'ora a quattro gradi Celsius al buio. Diluire una goccia di 0,2, 0,5 e una sospensione di perline di dimensioni micrometriche rispettivamente in un millilitro di PBS. Quindi eseguire ogni dimensione di perline per assicurarsi del gate scelto per le vescicole extracellulari e impostare la soglia del citometro a flusso per cercare le perle e la popolazione di vescicole extracellulari utilizzando un opportuno scatter interno in avanti.
Impostare la condizione terminale come calcolo di 100.000 particelle colorate di membrana e analizzare il campione tramite un citometro a flusso come descritto nel manoscritto. Risospendere i pellet in 50 microlitri di tampone di lisi RIPA e incubare per 30 minuti su ghiaccio. Per quantificare le concentrazioni proteiche di tutti i campioni nella micropiastra a 96 pozzetti mediante il test della proteina BCA, diluire i due milligrammi per millilitri di BSA con lo 0,9% di soluzione salina normale in 0,5 milligrammi per millilitri.
A 0,5 milligrammi per millilitro di BSA e 0,9% di soluzione salina normale in tre pozzetti duplicati con determinati volumi. Quindi far cadere due microlitri dei campioni e aggiungere 18 microlitri di soluzione salina normale in tre pozzetti duplicati separatamente. Dopo aver preparato una soluzione di lavoro mescolando il reagente BCA A con il reagente B, aggiungere 200 microlitri della soluzione di lavoro a ciascun pozzetto e agitare delicatamente per 30 secondi.
Quindi incubare la micropiastra a 96 pozzetti per 20-25 minuti a 37 gradi Celsius e misurare la densità ottica a 596 nanometri con lo spettrofotometro. Successivamente, esportare i dati, disegnare una curva standard e calcolare la concentrazione proteica dei campioni. Secondo i risultati, diluire i campioni a un microgrammo per microlitro con lo 0,9% di soluzione salina normale e cinque volte la concentrazione del tampone di carico SDS-PAGE e sigillare ermeticamente i tubi con pellicola e riscaldare per cinque minuti a 100 gradi Celsius.
Caricare i campioni nella scala proteica in una concentrazione gradiente dal quattro al 20% del gel tris di HEPy. Eseguire il gel nel tampone corrente a 80 volt fino a quando le proteine formano una linea. Quindi passare a 120 volt per un'ora fino a quando il colorante di carico è sul fondo del gel.
Trasferire il gel sulla membrana di fluoruro di polivinilidene preincubata in alcool metilico per 20 secondi utilizzando un sistema di trasferimento a umido per trasferire per un'ora a 200 milliampere. Preparare il tampone bloccante al 5% BSA aggiungendo 2,5 grammi di BSA e 50 millilitri di TBST in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Bloccare le membrane in questo tampone per due ore a temperatura ambiente con agitazione.
Incubare le membrane con anticorpi primari specifici diluiti con TBST in concentrazione adeguata durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte e incubare le membrane con anticorpi secondari adatti per un'ora a temperatura ambiente con agitazione. Dopo aver lavato le membrane nel tampone di lavaggio quattro volte, visualizzare le membrane utilizzando il kit di chemiluminescenza in un sistema di imaging del gel.
La microscopia elettronica a trasmissione e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche tipiche delle vescicole extracellulari erano rotonde e a forma di coppa con un diametro compreso tra 500 e 300 nanometri. L'analisi della citometria a flusso mostra le percentuali di specifici marcatori di membrana espressi sulle vescicole extracellulari che implica la loro origine dalle cellule madri. L'analisi Western blot mostra l'espressione di PGD e PKM2 rispettivamente come rappresentante del contenuto proteico e delle vescicole extracellulari plasmatiche e delle vescicole extracellulari ossee, indicando lo stato metabolico.
L'espressione negativa di Golgin-84 nelle vescicole extracellulari è stata rilevata con la presenza di mitofilina, alfa-actinina-4, flottilina-1, caveolina-1 e beta-actina, insieme al marcatore delle vescicole CD9, mentre l'espressione di CD81 è bassa o assente con una mancanza di APO-A-1 nelle vescicole extracellulari plasmatiche. Ricercatori, quindi tenendo presente che il passaggio 2.2, la preparazione e la digestione dei campioni di tessuto dovrebbero essere fatte a sufficienza. Altrimenti, il numero di vescicole extracellulari estratte dai tessuti è limitato.
Il marcatore marcato colorazione fluorescente delle vescicole extracellulari può essere iniettato nella bocca per trattare la fase che si collega alla funzione potenziale.
