Questo lavoro è stato supportato dalla Royal Melbourne Hospital Neuroscience Foundation (A2087).

Questo studio è stato approvato dal Florey Animal Ethics Committee (Università di Melbourne, n. 22-025UM) in conformità con il codice australiano per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici. Per il presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6 (8 settimane), ottenuti dall'Animal Resources Centre (Australia).
1. Progettazione e fabbricazione dell'headstage
NOTA: La scheda PCB headstage è una scheda compatta a quattro strati da 14 mm x 12 mm progettata per essere posizionata direttamente sulla testa dell'animale. Utilizza un chip amplificatore commerciale (vedi Tabella dei materiali) e tutti i file di progettazione e Gerber sono disponibili online (link GitHub: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).
<ol><li>Fornire le seguenti specifiche al produttore: Spessore del pannello: 0,6 mm; Tracciamento/spaziatura minima: 4 mil; Dimensione minima del foro: 0,2 mm.</li>
	<li>Durante il processo di assemblaggio del PCB, seguire questo ordine:<ol><li>Saldare il chip dell'amplificatore sulla scheda utilizzando una pistola ad aria calda impostata a 350 °C.</li>
		<li>Saldare i componenti passivi.</li>
		<li>Saldare il connettore SPI e il connettore dell'elettrodo (vedi Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Ispezionare la saldatura al microscopio per garantire la qualità. Fissare il connettore SPI in posizione utilizzando resina epossidica per una maggiore stabilità.</li>
	<li>Utilizzare un software di registrazione di terze parti e una scheda di controllo (vedere Tabella dei materiali) per l'acquisizione del segnale. Fare riferimento alla guida per l'utente del software per istruzioni dettagliate.</li>
	<li>L'headstage progettato supporta 8 canali. Nel software, abilitare i canali 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 e 23 per la registrazione.</li>
</ol>2. Fabbricazione di elettrodi
<ol><li>Tagliare i fili di tungsteno rivestiti in PFA (vedere la Tabella dei materiali) a lunghezze specifiche per diversi tipi di elettrodi: elettrodo della corteccia prefrontale (12 mm), elettrodo dell'ippocampo (10 mm) ed elettrodo di terra (6 mm).</li>
	<li>Tagliare il tubo di ottone (vedi Tabella dei materiali) in segmenti di 3 mm.</li>
	<li>Rimuovere 2 mm di rivestimento all'estremità di ciascun filo utilizzando un accendino, quindi saldare saldamente il filo dell'elettrodo al tubo di ottone. Il tubo in ottone ha un diametro interno di 0,45 mm e un diametro esterno di 0,60 mm.</li>
	<li>Per l'elettrodo di terra, saldare una vite in acciaio inossidabile M1.2 (vedere la tabella dei materiali) all'elettrodo. Applicare un flusso a base di acido fosforico alla vite per migliorare la saldatura. Dopo la saldatura, pulire la vite con alcool. NOTA: Indossare guanti per proteggersi durante il processo di saldatura.</li>
</ol>3. Procedura chirurgica
<ol><li>Anestetizzare il topo in una camera di anestesia con isoflurano al 3% e flusso di ossigeno di 1 L/min.</li>
	<li>Posizionare il mouse anestetizzato su un termoforo e fissarlo in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Regolare il tasso di mantenimento dell'isoflurano al 2,5-3% e ridurre il flusso di ossigeno a 500 ml/min. Usando il pizzico per le dita dei piedi, verifica se l'animale è ancora in anestesia profonda.</li>
	<li>Iniettare per via sottocutanea carprofene a 0,5 mg/kg e applicare un unguento oculare per la protezione degli occhi.</li>
	<li>Radere e sterilizzare la testa del topo utilizzando iodio povidone ed etanolo all'80%.</li>
	<li>Praticare un'incisione di 8 mm lungo la linea mediana del cuoio capelluto, rimuovendo il tessuto connettivo nell'area dell'incisione.</li>
	<li>Applicare acqua ossigenata per pulire la superficie del cranio, facendo attenzione a non toccare la pelle circostante.</li>
	<li>Allineare i punti di riferimento bregma e lambda allo stesso livello per un posizionamento accurato degli elettrodi (bregma e lambda sono il punto in cui la sutura sagittale interseca le suture coronali e lambdoidi).</li>
	<li>Praticare i fori per l'elettrodo di riferimento/rettificato, le viti di ancoraggio (fresa da 0.9 mm) e gli elettrodi attivi (fresa da 0.3 mm) alle coordinate specificate.</li>
	<li>Collegare l'elettrodo su misura (passaggio 2) al braccio del telaio stereotassico e assicurarsi che sia perpendicolare al cervello.</li>
	<li>Impiantare l'elettrodo nell'area CA1 dell'ippocampo (AP - 1,8 mm, ML - 1,3 mm, DV - 1,4 mm). NOTA: AP, anteroposteriore; ML, mediolaterale; DV, dorso-ventrale.</li>
	<li>Impianto ripetuto di elettrodi nella corteccia prefrontale (AP - 2,0 mm, ML - 0,3 mm, DV - 1,7 mm).</li>
	<li>Fissare gli elettrodi con un adesivo potente disponibile in commercio e cemento dentale (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Impianto di due viti di ancoraggio da 1,2 mm (AP - 1,8 mm, ML -1,6 mm) per impedirne il movimento.</li>
	<li>Posizionare l'elettrodo di riferimento/massa a diretto contatto con la dura madre, 2 mm posteriormente e 2 mm unilateralmente al punto di riferimento lambda.</li>
	<li>Collegare il lato del tubo di ottone degli elettrodi a un connettore femmina multicanale (vedi Tabella dei materiali) con l'elettrodo di terra al centro.</li>
	<li>Utilizzare una guaina termorestringente da 0,8 mm all'esterno del perno centrale per l'isolamento.</li>
	<li>Fissare gli elettrodi, le viti di ancoraggio e il connettore con adesivo e cemento dentale.</li>
</ol>4. Assistenza postoperatoria
<ol><li>Per alleviare il dolore postoperatorio, iniettare carprofene alla dose di 5-10 mg/kg per via sottocutanea ogni 12-24 ore sulla base di una valutazione del dolore per un periodo di tre giorni.</li>
	<li>Fornire all'animale un periodo di recupero di una settimana prima di iniziare qualsiasi registrazione o procedura sperimentale.</li>
</ol>5. Procedura di registrazione
<ol><li>Maneggiare l'animale per 15 minuti, due volte al giorno, per tre giorni consecutivi.</li>
	<li>Prendi i topi chiudendo delicatamente la mano intorno a loro senza applicare una pressione eccessiva.</li>
	<li>Posiziona la tavola headstage sulla testa dell'animale per 30 minuti una volta al giorno per tre giorni consecutivi.</li>
	<li>Il giorno della registrazione, acclimata l'animale nella sala di registrazione per 30 minuti.</li>
	<li>Posizionare l'animale in una piccola camera di registrazione all'interno di una gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettriche esterne. Allega l'headstage personalizzato per la registrazione.</li>
	<li>Aprire il software di registrazione e selezionare una frequenza di campionamento di 2,00 kHz. Disabilita tutti i canali tranne 13 e 20 selezionando ciascun canale e premendo la barra spaziatrice.</li>
	<li>Nella finestra della larghezza di banda hardware, impostare la larghezza di banda inferiore su 2 Hz e la larghezza di banda superiore su 100 Hz.</li>
	<li>Nella finestra di filtraggio del software, regolare il filtro passa-basso su 100 Hz e il filtro passa-alto su 2 Hz.</li>
	<li>Scegliere il percorso di archiviazione facendo clic su Seleziona nome file, quindi fare clic su Registra.</li>
	<li>Iniziare ogni sessione di registrazione con un periodo di assuefazione di 10 minuti seguito da una registrazione EEG di base di 15 minuti.</li>
	<li>Dopo la registrazione di base, somministrare il farmaco tramite iniezione intraperitoneale e continuare la registrazione per altri 30 minuti senza indugio. NOTA: Vedere la sezione Risultati per i dettagli sui farmaci utilizzati.</li>
</ol>

Registrazione LFP nel cervello di topo per la ricerca cognitiva e l'analisi dei farmaci

<ol>
	<li>Einevoll, G. T., Kayser, C., Logothetis, N. K., Panzeri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+and+analysis+of+local+field+potentials+for+studying+the+function+of+cortical+circuits.">Modelling and analysis of local field potentials for studying the function of cortical circuits.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (11), 770-785 (2013).</li><li>Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+extracellular+fields+and+currents-EEG,+ECOG,+LFP+and+spikes.">The origin of extracellular fields and currents-EEG, ECOG, LFP and spikes.</a> Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).</li><li>Sigurdsson, T., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A., Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+hippocampal-prefrontal+synchrony+in+a+genetic+mouse+model+of+schizophrenia.">Impaired hippocampal-prefrontal synchrony in a genetic mouse model of schizophrenia.</a> Nature. 464 (7289), 763-767 (2010).</li><li>Witton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted+hippocampal+sharp-wave+ripple-associated+spike+dynamics+in+a+transgenic+mouse+model+of+dementia.">Disrupted hippocampal sharp-wave ripple-associated spike dynamics in a transgenic mouse model of dementia.</a> J Physiol. 594 (16), 4615-4630 (2016).</li><li>Englot, D. J., Konrad, P. E., Morgan, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+global+connectivity+disturbances+in+focal+epilepsy,+related+neurocognitive+sequelae,+and+potential+mechanistic+underpinnings.">Regional and global connectivity disturbances in focal epilepsy, related neurocognitive sequelae, and potential mechanistic underpinnings.</a> Epilepsia. 57 (10), 1546-1557 (2016).</li><li>Pievani, M., De Haan, W., Wu, T., Seeley, W. W., Frisoni, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+network+disruption+in+the+degenerative+dementias.">Functional network disruption in the degenerative dementias.</a> Lancet Neurol. 10 (9), 829-843 (2011).</li><li>Sigurdsson, T., Duvarci, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal-prefrontal+interactions+in+cognition,+behavior+and+psychiatric+disease.">Hippocampal-prefrontal interactions in cognition, behavior and psychiatric disease.</a> Front Syst Neurosci. 9, 190 (2015).</li><li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+antipsychotic+drugs+and+potassium+channel+modulators+on+spectral+properties+of+local+field+potentials+in+mouse+hippocampus+and+pre-frontal+cortex.">Effects of antipsychotic drugs and potassium channel modulators on spectral properties of local field potentials in mouse hippocampus and pre-frontal cortex.</a> Neuropharmacology. 191, 108572 (2021).</li><li>Bokil, H., Andrews, P., Kulkarni, J. E., Mehta, S., Mitra, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronux:+A+platform+for+analyzing+neural+signals.">Chronux: A platform for analyzing neural signals.</a> J Neurosci Methods. 192 (1), 146-151 (2010).</li><li>Bozkurt, A., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+flexible+printed+circuit+technology+based+microelectrode+array+for+extracellular+stimulation+of+the+invertebrate+locomotory+system.">Low-cost flexible printed circuit technology based microelectrode array for extracellular stimulation of the invertebrate locomotory system.</a> Sens Actuator A Phys. 169 (1), 89-97 (2011).</li><li>Du, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+in+vivo+gastrointestinal+slow+wave+activity+using+flexible+printed+circuit+board+electrodes:+Methodology+and+validation.">High-resolution mapping of in vivo gastrointestinal slow wave activity using flexible printed circuit board electrodes: Methodology and validation.</a> Ann Biomed Eng. 37, 839-846 (2009).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroscience.+Histological+Staining+of+Neural+Tissue.">Neuroscience. Histological Staining of Neural Tissue.</a> JoVE. , (2023).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentato delinea la procedura per la costruzione di un headstage personalizzato specificamente progettato per la registrazione simultanea di potenziali di campo locali doppi (LFP) nell'ippocampo (HIP) e nella corteccia prefrontale (PFC). I passaggi dettagliati forniti in questo protocollo offrono informazioni sufficienti ai ricercatori per esaminare a fondo la comunicazione del segnale sia all'interno di ciascuna regione che tra HIP e PFC.
L'headstage progettato su misura u...

I potenziali di campo locali (LFP) si riferiscono all'attività elettrica registrata dallo spazio extracellulare, che riflette l'attività collettiva di un gruppo localizzato di neuroni. Presentano una vasta gamma di frequenze, che vanno dalle onde lente a 1 Hz alle oscillazioni veloci a 100 Hz o 200 Hz. Bande di frequenza specifiche sono state associate a funzioni cognitive come l'apprendimento, la memoria e il processo decisionale 1,2. I cambiamenti nelle proprietà LFP sono stati utilizzati come biomarcatori per vari disturbi neurologici, tra cui demenza e schizofrenia 3,4. L'analisi delle registrazioni LFP può offrire preziose informazioni sui meccanismi patologici sottostanti associati a queste condizioni e sulle potenziali strategie terapeutiche.
La doppia registrazione LFP è una tecnica utilizzata per misurare l'attività elettrica localizzata all'interno e tra due specifiche regioni del cervello. Questa tecnica offre una preziosa opportunità per studiare le intricate dinamiche neurali e la comunicazione del segnale che si verificano all'interno e tra regioni cerebrali distinte. Studi precedenti hanno rivelato che rilevare alterazioni nelle proprietà neuronali delle singole regioni cerebrali può essere complesso, ma si possono osservare cambiamenti nella comunicazione corticale interregionale 5,6. Pertanto, l'utilizzo della doppia registrazione LFP offre un potente mezzo per affrontare questo problema.
La connettività ippocampo-prefrontale svolge un ruolo cruciale nella modulazione delle funzioni cognitive e la disfunzione è stata collegata a vari disturbi neurologici 7,8. Le registrazioni a doppio elettrodo di queste regioni possono fornire informazioni su queste interazioni. Sfortunatamente, ci sono informazioni limitate disponibili sui metodi per eseguire registrazioni LFP a doppio elettrodo tra queste aree. Inoltre, i dispositivi di registrazione disponibili in commercio sono generalmente costosi e mancano di adattabilità a specifici disegni sperimentali. Il metodo convenzionale per la registrazione degli LFP prevede l'utilizzo di un cavo schermato per collegare il dispositivo di registrazione agli elettrodi impiantati nel cervello di un animale. Tuttavia, questo approccio è suscettibile di artefatti di movimento e rumore ambientale, con un impatto sulla qualità e sull'affidabilità dei segnali registrati.
Questo protocollo descrive una procedura completa per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale, utilizzando un headstage a basso costo progettato su misura che può essere posizionato sulla testa dell'animale. Questi metodi consentono ai ricercatori di studiare i modelli oscillatori specifici della regione all'interno di due regioni cerebrali discrete ed esplorare lo scambio di informazioni interregionali e la connettività tra queste aree.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brass tube&#160;</td>
			<td>Albion Alloys, USA</td>
			<td>Inside diameter of 0.45 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen&#160;</td>
			<td>Rimadyl, Pfizer Animal Health&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial amplifier chip</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHD 2132</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control board</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHD recording system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement&#160;</td>
			<td>Paladur</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat shrinks</td>
			<td>Panduit</td>
			<td>0.8 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M1.2 stainless steel screw</td>
			<td>Watch tools</td>
			<td>Clock and watch screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel socket connector&#160;</td>
			<td>Harwin, AU</td>
			<td>1.27 mm pitch, PCB socket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA-coated tungsten wires&#160;</td>
			<td>A-M SYSTEMS, USA</td>
			<td>Inside diameter of 150 &#181;m&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid-based flux</td>
			<td>Chip Quik</td>
			<td>CQ4LF-0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording software</td>
			<td>Intantech</td>
			<td>RHX recording software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotactic Frame</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Mouse stereotactic instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Ultra fast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dual extracellular recordings in the mouse hippocampus and prefrontal cortex

La tecnica di registrazione dei potenziali di campo locali (LFP) è un metodo elettrofisiologico utilizzato per misurare l'attività elettrica di popolazioni neuronali localizzate. Serve come strumento cruciale nella ricerca cognitiva, in particolare nelle regioni del cervello come l'ippocampo e la corteccia prefrontale. Le doppie registrazioni LFP tra queste aree sono di particolare interesse in quanto consentono l'esplorazione della comunicazione del segnale interregionale. Tuttavia, i metodi per eseguire queste registrazioni sono raramente descritti e la maggior parte dei dispositivi di registrazione commerciali sono costosi o mancano di adattabilità per adattarsi a specifici disegni sperimentali. Questo studio presenta un protocollo completo per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale per studiare gli effetti dei farmaci antipsicotici e dei modulatori dei canali del potassio sulle proprietà LFP in queste aree. La tecnica consente la misurazione delle proprietà LFP, compresi gli spettri di potenza all'interno di ciascuna regione del cervello e la coerenza tra i due. Inoltre, per questi esperimenti è stato sviluppato un dispositivo di registrazione a basso costo e progettato su misura. In sintesi, questo protocollo fornisce un mezzo per registrare segnali con elevati rapporti segnale-rumore in diverse regioni del cervello, facilitando l'indagine della comunicazione di informazioni interregionali all'interno del cervello.

I risultati qui mostrati dimostrano gli effetti di diversi farmaci sulle proprietà dei potenziali di campo locali (LFP) testati in quattro coorti di topi maschi C57BL/6 (n = 8 per ogni coorte; età: 8 settimane; peso: 24,0 ± 0,42 g). I farmaci testati includevano il farmaco antipsicotico clozapina, i modulatori dei canali del potassio 4-aminopiridina (4-AP) e la retigabina, nonché la soluzione salina del veicolo di controllo.
Come mostrato nella Figura 1, il to...

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Autore in primo piano: Studio dell'impatto dei farmaci sui segnali cerebrali utilizzando il protocollo di registrazione a doppio LFP nei topi

Questo protocollo delinea l'uso di un dispositivo di registrazione progettato su misura ed elettrodi per registrare i potenziali di campo locali e studiare il flusso di informazioni nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale.

Doppie registrazioni extracellulari nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale

The technique of recording local field potentials (LFPs) is an electrophysiological method used to measure the electrical activity of localized neuronal ...

Questo studio presenta un protocollo completo per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale per studiare gli effetti dei farmaci sulle proprietà LFP in queste aree. Questo protocollo fornisce un dispositivo di registrazione del segnale cerebrale a basso costo e ultraleggero completamente ottimizzato per la ricerca cognitiva nei topi. Questo studio fornisce un mezzo per registrare segnali con elevati rapporti segnale-rumore in diverse regioni del cervello, facilitando l'indagine della comunicazione di informazioni interregionali all'interno del cervello.

dual-extracellular-recordings-mouse-hippocampus-prefrontal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex

1.2K Views.  The University of Melbourne. Questo studio presenta un protocollo completo per l'esecuzione di registrazioni LFP a doppio elettrodo nell'ippocampo del topo e nella corteccia prefrontale per studiare gli effetti dei farmaci sulle proprietà LFP in queste aree. Questo protocollo fornisce un dispositivo di registrazione del segnale cerebrale a basso costo e ultraleggero completamente ottimizzato per la ricerca cognitiva nei topi. Questo studio fornisce un mezzo per registrare segnali con elevati rapporti segnale-rumore in d...

Video: Autore in primo piano: Studio dell'impatto dei farmaci sui segnali cerebrali utilizzando il protocollo di registrazione a doppio LFP nei topi

Correlating Behavioral Responses to fMRI Signals from Human Prefrontal Cortex: Examining Cognitive Processes Using Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar tasks. Participants' behavior during task performance in an fMRI scanner can then be correlated to the brain activity using the blood-oxygen-level-dependent signal. We measure behavior to be able to sort correct trials, where the subject performed the task correctly and then be able to examine the brain signals related to correct performance. Conversely, if subjects do not perform the task correctly, and these trials are included in the same analysis with the correct trials we would introduce trials that were not only for correct performance. Thus, in many cases these errors can be used themselves to then correlate brain activity to them. We describe two complementary tasks that are used in our lab to examine the brain during suppression of an automatic responses: the stroop1 and anti-saccade tasks. The emotional stroop paradigm instructs participants to either report the superimposed emotional 'word' across the affective faces or the facial 'expressions' of the face stimuli1,2. When the word and the facial expression refer to different emotions, a conflict between what must be said and what is automatically read occurs. The participant has to resolve the conflict between two simultaneously competing processes of word reading and facial expression. Our urge to read out a word leads to strong 'stimulus-response (SR)' associations; hence inhibiting these strong SR's is difficult and participants are prone to making errors. Overcoming this conflict and directing attention away from the face or the word requires the subject to inhibit bottom up processes which typically directs attention to the more salient stimulus. Similarly, in the anti-saccade task3,4,5,6, where an instruction cue is used to direct only attention to a peripheral stimulus location but then the eye movement is made to the mirror opposite position. Yet again we measure behavior by recording the eye movements of participants which allows for the sorting of the behavioral responses into correct and error trials7 which then can be correlated to brain activity. Neuroimaging now allows researchers to measure different behaviors of correct and error trials that are indicative of different cognitive processes and pinpoint the different neural networks involved.

The goal of our research is to correlate behavior to brain activity. Accurate behavioral measures and imaging techniques allow us to elucidate brain-behavior relationships.

Correlare risposte comportamentali alla segnali fMRI di Human corteccia prefrontale: Esame Processi Cognitivi Utilizzando Task Analysis

The aim of this methods paper is to describe how to implement a neuroimaging technique to examine complementary brain processes engaged by two similar ...

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Neuroscienze

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione in C57BL / 6 del mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

Stimolazione magnetica transcranica combinata e l'elettroencefalografia della corteccia prefrontale dorsolaterale

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s neuroprotective and therapeutic potential. Organotypic slices are prepared from explanted tissue and represent a complex multicellular ex vivo environment. They preserve the three-dimensional cytoarchitecture and local environment of brain cells, maintain the neuronal connectivity and the neuron-glia reciprocal interaction. Hippocampal organotypic slices are considered suitable to explore the basic mechanisms of epileptogenesis, but clinical research and animal models of epilepsy have suggested that the rhinal cortex, composed of perirhinal and entorhinal cortices, play a relevant role in seizure generation.
Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Recordings of spontaneous activity from the CA3 area under perfusion with complete growth medium, at physiological temperature and in the absence of pharmacological manipulations, showed that these slices depict evolving epileptic-like events throughout time in culture. Increased cell death, through propidium iodide uptake assay, and gliosis, assessed with fluorescence-coupled immunohistochemistry, was also observed. The experimental approach presented highlights the value of rhinal cortex-hippocampus organotypic slice cultures as a platform to study the dynamics and progression of epileptogenesis and to screen potential therapeutic targets for this brain pathology.

Here, we describe the preparation of rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Under a gradual and controlled deprivation of serum, these slices depict evolving epileptic-like events and can be considered an ex vivo model of epileptogenesis. This system represents an excellent tool for monitoring the dynamics of spontaneous activity, as well as for assessing the progression of neuroinflammatory features throughout the course of epileptogenesis.

Un modello di epileptogenesi nelle culture delle fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo

Organotypic slice cultures have been widely used to model brain disorders and are considered excellent platforms for evaluating a drug&#8217;s ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.