L'epilessia è una malattia neurologica prevalente. Le fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo raffigurano eventi epilettici in evoluzione che assomigliano all'epilessia in vivo e possono quindi essere utilizzati come modello ex vivo di epileptogenesi. Questo sistema è infatti un ottimo strumento per monitorare la dinamica e la progressione dell'epileptogenesi, nonché per lo screening di potenziali target terapeutici per questa patologia cerebrale.
A dimostrare le procedure con me saranno i miei studenti Francisco Meda e Mafalda Carvalho. Per raccogliere il cervello da un giorno postnatale da sei a sette cucciolo di Sprague-Dawley, lava la testa per la prima volta tre volte in cinque millilitri di GBSS. Lavorando in un armadio di biosicurezza, inserire saldamente forcep affilate nelle orbite degli occhi per tenere la testa in posizione e utilizzare forbici sottili per la punta per tagliare il cuoio capelluto lungo la linea mediana dal forame vertebrale ai lobi frontali.
Tagliare il cranio allo stesso modo e lungo la fessura trasversale cerebrale e utilizzare lunghe forcette curve per spostare i pezzi del cranio a parte. Usa una spatola per scartare i bulbi olfattivi e trasferire il lato dorsale cerebrale su in una piastra di 60 millimetri contenente cinque millilitri di GBSS freddo. Inserire le forcep fini nel cervelletto e inserire la spatola lungo la linea mediana per aprire con cura l'emisfero.
Utilizzare brevi forcelle curve per rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre l'ippocampo senza toccare la struttura ippocampale, quindi tagliare sotto ogni ippocampo. Trasferire un emisfero alla volta lato ippocampo verso l'alto e parallelo l'uno all'altro su un pezzo di carta da filtro. Posizionare la carta filtrante su un elicottero tissutale con gli emisferi perpendicolari alla lama e tagliare gli emisferi a fette da 350 micron.
Trasferire il tessuto affettato in una nuova piastra di Petri contenente cinque millilitri di GBSS freddo e utilizzare elettrodi a punta rotonda per separare accuratamente le fette mantenendo solo i campioni con una corteccia rinale strutturalmente intatta e ippocampo. Le aree della DG E della CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come le regioni della corteccia entorinale e perirhinale. Utilizzare una spatola e un elettrodo a punta rotonda per posizionare fino a quattro fette intatte su singoli inserti nel numero appropriato di pozzi di una piastra a sei poggiamenti contenente 1,1 millilitri di mezzo di coltura per pozzo.
Utilizzare una pipetta P20 per rimuovere qualsiasi mezzo di dissezione in eccesso da ogni fetta. Posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare. Cambia il mezzo ogni due o tre giorni.
Utilizzare le forcep per sollevare l'inserto. Aspirare il mezzo dal pozzo corrispondente e riposizionare l'inserto in posizione. Utilizzare una pipetta P1000 per aggiungere un millilitro di mezzo fresco di 37 gradi Celsius a ciascun pozzo.
Preparare la configurazione dell'elettrofisiologia in un circuito chiuso. Verificare che la portata della camera del tipo di interfaccia sia impostata su due millilitri al minuto e aprire la valvola carb-bue. Controllare il livello dell'acqua nel sistema e posizionare un pezzo di carta filtrante nella camera di registrazione dell'interfaccia per drenare qualsiasi mezzo in eccesso.
Posizionare un pezzo di carta per la pulizia dell'obiettivo sotto il telaio per fornire il mezzo alla fetta e accendere il regolatore di temperatura, gli amplificatori e i micro manipolatori. Utilizzare una siringa per caricare un elettrodo di vetro con liquido cerebrospinale artificiale preparato al momento. Posizionare l'elettrodo di vetro nell'elettrodo ricevente e attendere che la temperatura nella camera di interfaccia si stabilizzi a 37 gradi Celsius.
Lavorando in un armadio per la biosicurezza, posizionare l'inserto in una piastra da 60 millimetri con una goccia di mezzo. Utilizzare una lama affilata per tagliare una fetta dall'inserto e posizionare la fetta nella camera di interfaccia con l'ippocampo in basso a destra, quindi posizionare l'elettrodo ricevente nello strato di cella piramidale CA3, avviare il protocollo di acquisizione continua e registrare la fetta per 30 minuti. Per eseguire il test di assorbimento dello ioduro propidio, lavorare in un armadio di biosicurezza.
Sollevare l'inserto dal pozzo e aggiungere lo ioduro di propidio in media a una concentrazione finale di due micromolari per pozzo. Agitare lentamente la piastra prima di riposizionare l'inserto nel pozzo, facendo attenzione che non ci siano bolle sotto le fette. Una volta che tutte le fette sono state trattate, riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare.
Per l'immunosottenimento delle fette, al termine dell'incubazione del propidio ioduro, aspirare il mezzo dal fondo di ogni pozzo e aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 4% nella parte superiore e inferiore di ogni inserto. Dopo un'ora a temperatura ambiente, lavare le fette due volte per 10 minuti e un millilitro di PBS per lavaggio e utilizzare una penna idrofobica per disegnare due rettangoli su vetrini al microscopio. Utilizzare una lama affilata per tagliare le fette dagli inserti e posizionare una fetta in ogni rettangolo.
Aggiungere la soluzione di blocco della permeabilizzazione su ogni fetta per un'incubazione di tre ore a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere gli anticorpi primari di interesse a ogni fetta per un'incubazione di quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, lavare le fette con PBS-Tween tre volte per 10 minuti per lavaggio e incubare le fette con gli anticorpi secondari appropriati per quattro ore a temperatura ambiente.
Successivamente, lavare le fette come dimostrato e aggiungere 50 microlitri di soluzione hoechst ad ogni fetta per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione di Hoechst, lavare nuovamente le fette e aggiungere 50 microlitri di mezzo di montaggio a ciascuno, quindi posizionare un copripasta sulle fette e sigillare con smalto per unghie. Dopo aver permesso che i vetrini si asciughino per 24 ore a temperatura ambiente, visualizzare l'immunostaining e l'assorbimento di ioduro di propidio mediante microscopia confocale.
Le fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo raffigurano un'attività mista interictale e ictale a sette giorni in vitro. A 14 giorni in vitro, l'attività spontanea è caratterizzata da scarichi ictal, che si evolvono a un'attività ictal travolgente a 21 giorni in vitro con eventi ictal della durata superiore a un minuto. L'assorbimento di ioduro propidio e l'immunoistochimica contro il marcatore neuronale NeuN hanno rivelato una morte neuronale in sette giorni di fette in vitro che è notevolmente aumentata a 14 giorni in vitro in tutte le aree dell'ippocampo.
A sette giorni in vitro, le microglia ramificate con una bassa espressione di CD68 sono più abbondanti delle microglia reattive positive cd68 positive Iba1. Mentre a 14 giorni in vitro, in tutte le aree dell'ippocampo, Iba1 positivo CD68 positivo ameboide M1 microglia superano le microglia con una bassa espressione cd68. A 14 giorni in vitro, è possibile individuare alcune cellule positive cd68 positive Iba1 con un aspetto iper ramificazione, suggerendo la possibilità di un fenotipo di microglia antinfiammatorio M2.
A sette giorni in vitro, l'espressione del CD3 è appena rilevabile, mentre in 14 giorni affettazioni in vitro, si possono osservare astrociti positivi positivi alla proteina fibrillare gliale ipertrofica CD3, suggerendo una progressiva attivazione degli astrociti A1. Preparare fette di corteccia-ippocampo rhinal con estrema cura. Assicurati di rimuovere il tessuto in eccesso sopra l'ippocampo in quanto può compromettere l'integrità delle fette durante l'affettare.
Il deficit strutturale avrà un impatto negativo sulla redditività delle fette. Oltre agli approcci dimostrati, una pletora di test come l'analisi western blot, la PCR in tempo reale e l'ELISA possono essere applicati a questo sistema per affrontare domande specifiche riguardanti l'epileptogenesi.
