Gli autori desiderano ringraziare Dana Kamalidenova, Morgan Autexier, e Rocco Chopier, che ha fatto il video e animazioni, così come Florian Beck per le fotografie e la post-produzione del video voice-over. Questo lavoro è stato sponsorizzato da Olympus e sostenuto dalle concessioni dal HFSPO (Sviluppo Premio alla Carriera), ANR (Jeunes Chercheurs programma e il programma Blanc Neuroscienze), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM e La Pitié Salpêtrière (ricerca traslazionale contratto) a NR, dal francese di ricerca Ministero e Deutsche Forschungsgemeinschaft borse postdoc a UP, e dalle scuole di dottorato &quot;Frontiere della scienza della vita&quot;, Università Paris Diderot, Bettencourt Schuller fondazione, e FRM (Fondation pour la Recherche Médicale) dottorato di JS

1. Preparazione del liquido cerebrospinale artificiale e soluzione intracellulare <ol><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, si deve preparare la soluzione interna per registrazioni clamp la patch, così come il fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per la preparazione ippocampo. Avrete inoltre bisogno di un kit composto da dissezione forbice chirurgica e fine forbice iris, due spatole e pinze (strumenti per le scienze Arti), un dispositivo di emissione di gas di vetro (micro-filtro candela, ROBU Germania) e griglia di tessuto (zanzariera o nylon stretto), così come colla (Dent Uhu). La configurazione del setup cerotto fetta elettrofisiologia è stato descritto da Finkel &amp; Bookman, 2001 1. </li><li> Per la soluzione interna, sciogliere (in mM): 105 K-gluconato, KCl 30, 10 HEPES e EGTA 0,3 in acqua deionizzata (nel 70-80% del volume finale). Raffreddare la soluzione a 4 ° C e aggiungere (in mM): 4 Mg-ATP, GTP-Tris 0,3 e 10 fosfocreatina. Regolare il pH a 7,4 con KOH e riempimento up con acqua deionizzata per il volume finale. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Filtrare la soluzione (dimensione dei pori 0,2 micron). Aliquotati soluzione è stabile per 3-4 settimane a - 20 ° C. Per un giorno sperimentale, ~ 1 ml di soluzione interna è necessaria. </li><li> Se non diversamente indicato, il ACSF usato per la preparazione ippocampo e registrazioni di cellule nella regione CA1, contenente (in mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, CaCl 2 2,5, 1,3 MgSO 4, 1 NaH 2 PO 4, 26,2 NaHCO 3 e 11 glucosio. Sciogliere questi sali in acqua deionizzata (Osmolarità ~ 320 mOsm) e ossigenare la soluzione per almeno 10 minuti (pH ~ 7,3-7,4) con CarboGen (95% O 2 e il 5% di CO 2). Preparare almeno 1 litro di soluzione per esperimento. Particolare cura deve essere presa per la preparazione di tessuto dell&#39;ippocampo che verrà utilizzato per eseguire esperimenti nella regione CA3 dell&#39;ippocampo. Infatti, questa regione è soggetta a epilettiformi attività e successiva morte neuronale. Così SYNAPTattività IC deve essere fortemente ridotta durante la preparazione fetta, e questo si ottiene eseguendo la dissezione dell&#39;ippocampo in ghiacciata soluzione di saccarosio contenente (in mM): NaCl 87, 2,5 KCl, CaCl 2 0,5, 7 MgCl 2, 1 NaH 2 PO 4 , 25 NaHCO 3, 10 e 75 Saccarosio Glucosio. In questa soluzione, la combinazione di sodio bassa, bassi livelli di calcio e magnesio concentrazioni elevate massicciamente ridurre cottura presinaptica e probabilità di distacco, nonché postsinaptica attività del recettore NMDA, minimizzando attività spontanea e la morte cellulare. Una volta preparata, fettine ippocampali utilizzati per registrazioni di cellule della regione CA3 vengono perfuse con ACSF modificato, contenente 4 mM CaCl 2 e 4 MgSO 4, per ridurre al minimo l&#39;attività polisinaptici. </li></ol> 2. Acuta Preparazione Slice ippocampale <ol><li> Raffreddare ~ 300 ml di ACSF per la camera di taglio, così come per la preparazione a 4 ° C, mentre costantemente ossigenante conCarboGen. Preparare un piccolo becher con ACSF a temperatura ambiente (RT) per la memorizzazione slice, che è anche ossigenato con carbogeno (Schema Figura 1). </li><li> Anestetizzare il mouse sotto una cappa con un tovagliolo di carta imbevuto piccola con 1 ml di isoflurano che viene aggiunto nella gabbia. </li><li> Dopo che il mouse è profondamente anestetizzato, tagliare la testa e inserirlo direttamente in un piccolo piatto con ghiacciata ACSF ossigenato. Rimuovere il cuoio capelluto con una piccola forbice e trasferire la testa sul tessuto per le fasi successive. Iniziare a sezionare l&#39;ippocampo, come illustrato e descritto in Figura 1. </li><li> Tagliare 300-400 micron fette trasversali a bassa velocità (3 micron / sec) e la frequenza di vibrazione di 70 Hz a freddo ghiaccio ossigenato ACSF, e trasferirli in una camera di stoccaggio. Lasciare riposare le fette a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima della registrazione. Fette per CA3 esperimenti sono memorizzati 25 min a 34 ° C e almeno 30 min a RT, per recuperare dal processo di taglio. </li></ol&gt; 3. Doppia registrazione di Evocati Correnti astrogliale e potenziali di campo neuronali Noi qui viene descritto come registrare sinapticamente-evocato risposte astrogliali e neuronale, vale a dire le risposte indotte dalla attivazione delle sinapsi attraverso la stimolazione afferenza utilizzando un elettrodo extracellulare. <ol><li> Costantemente perfondere camera di registrazione con ACSF ossigenato (1,5-2 ml / min, RT), contenente 100 mM picrotossina (GABA A antagonista) per isolare risposte eccitatorie. Trasferire una fetta su un poli-L-lisina (1,5 a 3 mg / ml) coprioggetto rivestiti, immergere il liquido per ottenere una buona adesione fetta e aggiungere una goccia di ASCF sopra della fetta. Posizionare il vetrino nella camera di registrazione. Il blocco della trasmissione inibitoria da picrotossina può provocare attività epilettiforme, cioè spontaneo, cottura sincrona di popolazioni neuronali, che distorcono la misurazione degli eventi evocati. Così, per impedire attività epilettiforme, effettuare unataglio piatto (solo la superficie) tra le regioni CA1 e CA3 per impedire la propagazione attraverso il collaterali Schaffer (come indicato in Figura 2a). </li><li> Stratum radiatum astrociti possono essere identificati dalla loro dimensione soma piccolo (circa 10 micron) e processo di assemblaggio stellate. Scegli una cella almeno 20-30 micron sotto la superficie fetta. Montare un elettrodo di stimolazione di vetro (resistenza tip ~ 1 MW) sul filo d&#39;argento che è collegato alla scatola isolamento stimolo e messa a terra per il bagno (semplicemente avvolgendo il secondo filo argento intorno pipetta di vetro). Posizionare l&#39;elettrodo di stimolazione nella regione collaterale Schaffer, come indicato in Figura 2A a una distanza di 200-300 micron di distanza dal astrociti scelto. Montare l&#39;elettrodo di registrazione di campo (~ 2-5 MW) su un filo di argento clorurato collegato al headstage dell&#39;amplificatore. Entrambi gli elettrodi sono riempiti prima con ACSF. Scegliere in modo Multiclamp I = 0, che disabilita com esternocomando di input e posizionare l&#39;elettrodo ~ 50 pm dal astrociti nella regione stratum radiatum (Figura 2A). Registrare le risposte con Gain 2 a 10 e filtro con un filtro di Bessel 2 kHz. Iniezione di corrente elettrica nel cervello innesca fetta potenziali d&#39;azione nei dintorni assoni collaterali Schaffer e il rilascio del trasmettitore successivo ai terminali presinaptici che postsinaptici progetto di neuroni piramidali CA1. I trasmettitori rilasciati attiverà un flusso di carica positiva nelle cellule attraverso i recettori post-sinaptici ionotropici, che è misurabile extracellulare come un potenziale piccolo negativo. Questo campo potenziale postsinaptico eccitatorio (fEPSP) integra l&#39;attività di un gruppo di neuroni attivi contemporaneamente, mentre la trasmissione inibitorio è bloccato farmacologicamente. Applicare alcuni impulsi di test (0.1 msec durata) per evocare un fEPSP, alcuni riposizionamento degli elettrodi di stimolazione potrebbe aiutare ad aumentare la fEPSP. Un tipico CA1 strato Radiatum fEPSP è illustrato nella figura 2B. Ulteriori dettagli sul posizionamento e la risposta forme d&#39;onda possono essere trovati in Yuan et al. 2003 2. L&#39;ampiezza fEPSP in una fetta sana dell&#39;ippocampo di solito dovrebbe essere più di due volte più grande come l&#39;ampiezza del volley fibra. Per la quantificazione accurata di ampiezza fEPSP o pendenza, il reponse evocato deve essere monosinaptico, come attività polisinaptici (rilevabile come un multi-picco di risposta) indica l&#39;attività sinaptica indipendente dalla stimolazione elettrica, che potrebbe essere un segno per ipereccitabilità. Per gli esperimenti effettuati nella regione CA3 dell&#39;ippocampo, stimolazione e pipette di registrazione sono posizionati come illustrato in Figura 3C. Per identificare in modo chiaro gli ingressi in fibra di muschio, che sono fortemente accoppiati, facilitando impulsi di stimolazione (50 msec dell&#39;impulso intervallo) e 1 Hz stimolazione per alcuni secondi vengono applicati per migliorare in maniera massiccia l&#39;ampiezza inizialmente basso evocato fEPSP responses.At finedell&#39;esperimento, DCGIV, un recettore mGluR2 / 3 antagonista, può essere lavato per verificare ulteriormente che gli ingressi fibre muschiose effettivamente stati stimolati. L&#39;applicazione di questo antagonista dovrebbe ridurre il fEPSP da ~ 90% a causa della alta espressione di mGluR2 / 3 recettori inibendo rilascio presinaptico da boutons fibre muschiose. </li><li> Riempire una pipetta patch (~ 2-5 MW) con filtrato soluzione interna e montarlo su un filo di argento clorurato collegato al secondo headstage, applicare una pressione positiva con una siringa, che è collegato mediante un tubo al portapipette. Costantemente applicare un impulso di prova 20 msec di 10 mV e spostare la pipetta nel tessuto fino a raggiungere la superficie cellulare e le deformazioni della membrana diventa visibile. Azzerare la pipetta offset, togliere la pressione positiva, e bloccare la membrana - mV 80. Attendere fino a quando un gigaseal (almeno 1 GΩ) viene raggiunto (non dovrebbe richiedere più di alcuni secondi). Applicazione delicata di qualche pressione negativa potrebbe aiutare a raggiungere agigaseal. Penetrare nella cellula viene raggiunto da una breve applicazione di pressione negativa o utilizzando la funzione zap in Multiclamp. Avviare la registrazione simultanea delle garanzie Schaffer evocato fEPSP e la risposta astrogliale in voltage-clamp (Vhold - 80 mV; frequenza di 0,1 Hz guadagno, filtro di Bessel 2 kHz, 10). La risposta astrogliale attuale è bifasica: in primo luogo si vedrà una veloce corrente transitoria verso l&#39;esterno, che riflette fEPSPs generati dalle adiacenti cellule piramidali. Questo è seguito da un lento aumento e decadente verso l&#39;interno (secondi alcuni persistenti (&gt; 10 sec) dopo il termine delle risposte neuronali) attuali. Questa corrente è dovuto principalmente all&#39;entrata potassio in astrociti, seguito dal rilascio circostante depolarizzate terminali postsinaptici. Un attivati ​​contemporaneamente veloce trasportatore del glutammato transitorio di corrente (GLT), innescato da rilascio di glutammato presinaptico è mascherato dalla corrente di potassio. Il potenziale di mantenimento della astrociti, così come la resistenza accesso del cerotto deve essere monitored tutto l&#39;esperimento e non deve variare di oltre il ~ 20%, al fine di evitare il controllo impreciso di reponses astrogliali a causa di variazioni delle condizioni di registrazione. Astrociti Solo con una potenzialità iniziale di partecipazione&gt; -70 mV devono essere indagati per studiare le cellule sane. </li><li> Passare dalla tensione e corrente-clamp, al fine di registrare la depolarizzazione della membrana evocato astrociti. Isolare il trasportatore del glutammato gliale (GLT) corrente perfusione dell&#39;acido ionotropici bloccante del recettore glutammato chinurenico (5 mM), finché il fEPSP è completamente bloccato e l&#39;ampiezza GLT ha raggiunto un plateau. Per identificare con chiarezza l&#39;attuale GLT, applicare l&#39;antagonista specifico DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic acido (DL-TBOA, 200 pM). Aumentare la forza stimolazione da due volte a 5 volte per registrare le risposte neuronali e astrogliale a diversa forza sinaptica, e applicare due stimoli ravvicinati intervallo (50 msec) per indagare le risposte alla stimolazione impulsi accoppiati. Stabilità della serie rpotenziale esistance e la membrana della cellula gliale devono essere monitorate per la registrazione. </li><li> Per visualizzare l&#39;entità del gap-junction mediata reti astrogliali, colorante esperimenti di accoppiamento deve essere eseguito in modalità current clamp, senza alcuna corrente di iniezione, per consentire la diffusione passiva di coloranti molecolari bassi (&lt;1,5 kDa), come solforodamina-B, attraverso i canali di giunzione gap. Per minimizzare spillover colorante nel tessuto circostante, pressione positiva deve essere applicato tramite pipetta patch basta quando entrano nel tessuto e la patch dovrebbe essere raggiunto il più presto possibile. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Registrazione doppio di sinapticamente-indotte risposte neuronali e gliali è un metodo utile per studiare le alterazioni online in attività pre-e post-sinaptica associati a cambiamenti nelle proprietà astrogliali. La depolarizzazione della membrana sinapticamente-evocata gliale è una misura diretta della crescita extracellulare di potassio 8, in parte a causa di cottura presinaptico potenziale d&#39;azione, ma soprattutto per depolarizzazione postsinaptica 7. Pertanto le registrazioni della dinamica gliali potenziale di membrana può essere utilizzata per studiare le modifiche in eccitabilità presinaptico, attività post-sinaptica, il volume dello spazio extracellulare e capacità buffer di potassio 6, 8. Il astrogliale attuale trasportatore del glutammato è una misura sensibile di rilascio di glutammato presinaptico, in grado di monitorare cambiamenti a breve termine di probabilità di rilascio 3, 5, 9. Può inoltre essere utilizzato per caratterizzare le sinapsi funzionali-glia interazioni a livello delle sinapsi diversi o in differenti st sviluppoetà 10. Va sottolineato che GltS sono altamente sensibili alla temperatura 11 e sono azionati dal gradiente elettrochimico del Na +, K + e H 12. Così l&#39;ampiezza e la cinetica della corrente GLT fortemente dipendente dalle condizioni sperimentali adottate. Inoltre, la durata effettiva di liquidazione glutammato astrogliale derivata dalla corrente GLT registrata è noto per essere parzialmente oscurato. Ciò è dovuto al filtraggio delle correnti GLT da fattori come le proprietà elettrotoniche astrociti o lo svincolo trasmettitore asincrono che alterano la cinetica 13. Metodi di estrazione delle caratteristiche temporali dei meccanismi di filtraggio sono state sviluppate e possono essere utilizzati per ricavare la distanza effettiva corso glutammato tempo in condizioni fisiologiche o patologiche, come recenly eseguita 6,13,14. Inoltre, la registrazione simultanea della depolarizzazione della membrana astrogliale, nel morsetto corrente, può fornire INSIGhts in possibili alterazioni del potassio extracellulare transitori. Astrociti singolo contatto fino a 100.000 sinapsi di circa 100 neuroni diversi, e sono perciò integrare e modulare l&#39;attività di reti neuronali locali. Quando si utilizza la tecnica qui presentati, vale a dire la registrazione elettrofisiologiche di cellule intere interventi di astrociti di acquisire conoscenze in attività sinaptica basale, si dovrebbe tenere a mente che in astrociti, patch-clamp a livello soma consentire correnti di rilevamento per lo più provenienti dal soma cellulare o processi prossimali. Infatti, le correnti rilevati al soma solo in parte provengono da sottili processi distali quando una forte attivazione dei recettori e dei canali si verificano in più processi sottili in grado di generare correnti che si propagano al soma cella. Così recettore basale e l&#39;attività dei canali in singoli piccoli processi astrogliali coprono compartimenti sinaptici è difficilmente rilevabile. Ciò è dovuto in parte alla limitata battibeccocontrollo IAL e temporale delle correnti di membrana e delle tensioni di cellule intere patch-clamp da astrociti in situ. Tuttavia, va notato che la superficie delle abbondanti processi minuscoli astrocitari supera di gran lunga l&#39;area della membrana dei processi soma e principale. Inoltre, questi microdomini perisynaptic astrogliali contengono i recettori funzionalmente rilevanti e canali, che probabilmente svolgono un ruolo importante nella comunicazione neuroglia e regolazione sinaptica. La tecnica che abbiamo presentato qui è quindi particolarmente utile per studiare l&#39;integrazione di attività sincrona astrociti da insiemi neuronali, che si verifica in particolare durante la stimolazione afferenza. Essa non deve essere usato per studiare il dialogo tra singole sinapsi ei processi adiacenti pregiati astrocitari verificano durante basale attività spontanea. Un metodo alternativo per studiare locali astrogliali risposte indotte da basale sinaptica sarebbe effettuare patch-clamp da processi sottili, come duno in dendriti 15. Anche se l&#39;applicazione di patch questi processi belle astrogliali è probabilmente difficile a causa delle loro piccole dimensioni, è probabilmente la strada da seguire per svelare dialogo più intimo tra microdomini astrogliali e sinapsi individuali. Tuttavia, le probabili piccole risposte elettrofisiologiche astrogliali derivanti dai singoli processi sottili astrogliali può essere al di sotto della soglia di rilevazione, dal momento che il rumore elettrico raggiunge in media 3-5 pA in patch-clamp. Un altro metodo per studiare le risposte astrogliali l&#39;attività sinaptica è l&#39;imaging di calcio, dal momento che l&#39;attivazione dei recettori di membrana astrocitari o trasportatori di sostanze neuroattivi può innescare transienti di calcio intracellulare. Tuttavia, caricamento di massa degli astrociti con indicatori di calcio può anche riflettono principalmente l&#39;attività somatica 16. La combinazione di imaging elettrofisiologia e di calcio permette anche di rilevare segnali di calcio di piccole dimensioni da sottili processi astrogliali, possono essere di origine spontanea o innescata by minima stimolazione sinaptica 17, 18. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che ad alta affinità indicatori di calcio potrebbe agire come buffer di calcio, inibendo le vie di segnalazione di calcio importanti, mentre a bassa affinità indicatori potrebbe funzionare sotto il livello di rilevamento. Infine, una tecnica elegante e non invasivo per studiare gli eventi di calcio in sottili processi astrocitari, che aggira anche il dilavamento di molecole di segnalazione intracellulare durante whole-cell patch-clamp, consiste nell&#39;utilizzare un sensore mirato calcio membrana, che può essere espresso in astrociti in situ, come pure in vivo 19. Tuttavia, l&#39;imaging di calcio può fornire solo informazioni su una molecola di segnalazione, che è coinvolto in molte, ma non tutte le attività cellulari, mentre whole-cell patch-clamp fornisce informazioni quantitative su tutte le diverse correnti ioniche attivate su canale e l&#39;attivazione del recettore. Registrazioni elettrofisiologiche Pertanto simultanei da neuroni e astrocitisono un metodo unico e potente per svelare on-line le dinamiche di neuroglia segnalazione ionica e il suo cervello l&#39;elaborazione ruolo dell&#39;informazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Picrotoxin </td><td> Sigma </td><td> P1675 </td><td> sciogliere in DMSO </td></tr><tr><td> Acid Kynurenic </td><td> Tocris </td><td> 0223 </td><td> sciogliere a 34 ° C agitazione o sonicazione </td></tr><tr><td> DL-TBOA </td><td> Tocris </td><td> 1223 </td><td> DCG IV Tocris 0975 </td></tr></tbody></table>

dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices

Gli astrociti formano insieme con le sinapsi dei neuroni tripartite, in cui integrare e modulare l&#39;attività neuronale. In effetti, gli astrociti sentire ingressi neuronali attraverso l&#39;attivazione dei loro canali ionici e recettori dei neurotrasmettitori, ed elaborare le informazioni in parte attraverso attività-dipendente rilascio di gliotransmitters. Inoltre, astrociti costituiscono il sistema principale di assorbimento per glutammato, contribuiscono al potassio buffer spaziale, nonché alla clearance GABA. Queste cellule quindi costantemente monitorare l&#39;attività sinaptica, e in tal modo sono indicatori sensibili per alterazioni sinapticamente glutammato rilasciato, i livelli di potassio e GABA extracellulare. Inoltre, alterazioni dell&#39;attività assorbimento astrogliale o capacità tampone può avere effetti gravi sulle funzioni neuronali, e può essere trascurato quando caratterizzare situazioni fisiopatologiche o topi knockout. Doppia registrazione delle attività neuronali e astrogliale è quindi un metodo importante per studiare alterazioniforza sinaptica associata al concomitante cambiamenti di assorbimento e capacità di buffering astrogliale. Qui si descrive come preparare fettine di ippocampo, modalità di identificazione strato astrociti radiatum, e come per registrare le risposte elettrofisiologiche neuronali e contemporaneamente astrogliale. Inoltre, si descrive come isolare le correnti farmacologicamente sinapticamente-evocati astrogliali.

Un rappresentante registrazione simultanea di synaptically-risposte evocate astrogliali e neuronali (fEPSPs) nell&#39;area CA1 dell&#39;ippocampo è mostrato in Figura 2 AB. La corrente evocata astrogliale è bifasica, cioè costituito da una corrente transitoria verso l&#39;esterno e una corrente lenta decomposizione attivo (&gt; 10 sec) (Figura 2B). La corrente verso l&#39;esterno riflette la fEPSP evocato, ed è bloccato dopo l&#39;inibizione dei recettori del glutammato ionotropici da acido chinurenico (grigio scuro traccia, figura 2B) 3. La maggior parte della corrente lenta verso l&#39;interno riflette entrata potassio nel seguente astrociti depolarizzazione postsinaptica, essendo anche abolito da acido chinurenico, che inibisce l&#39;attività postsinaptica glutammato ionotropici recettore (Figura 2B e 2C Figura 1) 3-6, noto per rappresentare la principale di origine (80%) del rilascio di potassio 7. Il restante un rapido aumentod corrente di decadimento verso l&#39;interno è inibito dal antagonista GLT DL-TBOA (grigio chiaro traccia, figura 2B 2C e Figura 2). Post-hoc sottrazione della corrente residua lento in TBOA (grigio chiaro traccia) dalla corrente in acido chinurenico (grigio scuro traccia) permette l&#39;isolamento del trasportatore puro glutammato astrogliale corrente (traccia nera), come illustrato in Figura 2C 2. Il persistente lentamente decadere corrente in acido chinurenico e TBOA (grigio chiaro traccia, Figura 2B e 2C Figura 2) può essere bloccata da TTX (dati non mostrati), e riflette più probabile l&#39;accumulo di K + extracellulare rilasciato durante la cottura presinaptica afferente 3. Moderata stimolazione singola collaterali di Schaffer induce una corrente relativamente grande synaptically-evocata astrogliale rispetto alla depolarizzazione piccola evocata registrata nella stessa cella (Figura 2D). Ciò è dovuto almembrana bassa resistenza di astrociti. Registrazione della dinamica membrana synaptically-astrogliali potenziali evocati, come illustrato nella Figura 2D, è una misura diretta di locali livelli extracellulari di potassio 8. Normalizzazione delle risposte evocate astrogliali all&#39;attività neuronale sottostante permette il confronto diretto di diversi esperimenti, come recentemente dimostrato 6. Correnti astrogliali può inoltre monitorare molto affidabile alterazioni trasmissione eccitatoria, come la corrente totale synaptically-evocata astrogliale segue linearmente l&#39;aumento del fEPSP (Figura 2E). Correnti astrogliali riflettono anche a breve termine plasticità sinaptica, dal momento che mostrano, come i neuroni, abbinato impulsi facilitazione (Figura 2F). Accoppiato a cellula intera registrazione di una cella CA1 piramidale ed un astrocita rivelano molto diverso comportamento elettrofisiologico in entrambi i tipi cellulari, poiché i potenziali di azione di visualizzazione neuronali in risposta ad un impulso depolarizzante,mentre il astrocyte vicina è silenzioso (Figura 3A-B). Tuttavia, la stimolazione moderata delle collaterali Schaffer può evocare simultaneamente una rapida potenziale eccitatorio posynaptic nella cella CA1 piramidale e un veloce e lento correnti esteriori attivo in astrociti adiacente (3B Figura 2). Registrazioni duali di synaptically-evocate risposte neuronali e astrogliale possono anche essere registrati nell&#39;area CA3 dell&#39;ippocampo, come mostrato in Figura 3C. Infatti, la stimolazione singola di CA3 fibre muschiose evoca in condizioni basali risposte neuronali molto piccoli, registrati come fEPSPs locali, associati a piccoli veloci correnti di andata e lento verso l&#39;interno negli astrociti (Figura 3D 1). In contrasto, 1 Hz stimolazione di CA3 fibre muschiose per alcuni secondi potenzia fortemente la fEPSP, mentre solo moderatamente aumenta la risposta astrogliale (Figura 3D 2). Figura 1. Isolamento Hippocampus per preparare sezioni trasversali. A sezionare il cervello, tagliare il cranio lungo la linea mediana (a). Eseguire un taglio coronale a livello del bulbo olfattivo (b) e successivamente a livello del cervelletto (c). Rimuovere con cura il cranio con l&#39;aiuto di una pinza (d), separare i due emisferi con una lama (e), e trasferirli su un cucchiaino in freddo ACSF ossigenato (f). Dopo ~ 5 min equilibrazione, collocare un emisfero su tessuto asciutto con la superficie mediale up (g). Con l&#39;aiuto di due cucchiai rimuovere il diencefalo (hj). L&#39;ippocampo è ora visibile, come illustrato dalle linee tratteggiate (k). Sezionare l&#39;ippocampo con un cucchiaio, partendo dalla fimbria, visibile come struttura bianca (lm). Trasferire l&#39;ippocampo di nuovo nel ACSF freddo. Preparare una piccola agarosio-blocco, la posizione di due ippocampi con il lato alveus e l&#39;ippocampo ventraleci rivolto verso il bordo del blocco di agar, e immergere accuratamente tutto il liquido di distanza per permettere un buon attacco alla agar (n). Colla l&#39;ippocampo attaccato al blocco agar sulla parte ventrale (o). <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig2highres.jpg"/> Figura 2. Simultanee risposte neuronali e astrogliale evocati-sinapticamente nell&#39;area CA1 dell&#39;ippocampo. A) Schema della fetta ippocampale illustra la disposizione dell&#39;elettrodo stimolante, per attivare il collaterali Schaffer (SC), l&#39;elettrodo pipette patch, per registrare correnti astrocitari, e l&#39;elettrodo extracellulare, per registrare fEPSP, evocata dalla stimolazione SC nel hippocampal CA1 area. B) le tracce rappresentativi di registrazioni simultanee di fEPSPs (pannello superiore) e le correnti astrocitari (pannello inferiore) evocati-sinapticamente di stimolazione SC nel presence di droghe farmacologiche. Le risposte sono registrate prima in presenza di un antagonista del recettore GABA A (picrotossina, 100 pM, tracce nere) per isolare risposte eccitatorie. Successiva applicazione di un bloccante dei recettori ionotropici del glutammato (acido chinurenico, 5 mM, tracce grigio scuro), inibisce la fEPSP e la maggior parte della corrente di lunga durata astrogliale, smascherando una piccola componente e veloce transitoria della risposta astrocitica corrente, che è sensibili a un bloccante trasportatore del glutammato (TBOA, 200 pM, tracce grigio chiaro). Barra Scala, fEPSP 0,1 mV, astrociti attuali 15 pA, 10 msec. C 1). Traccia campione del potassio astrogliale corrente (1-2), che può essere isolato dalla risposta evocata, mostrato in B (pannello inferiore, nero traccia), sottraendo la componente di corrente residua in acido chinurenico (2) dalla corrente totale ( 1). Barra Scala, 20 pA, 1 sec. C 2) traccia Campione del trasportatore del glutammato corrente (2-3), ottenuto sottraendo il i TBOAnsensitive componente lenta (3) dalla corrente in acido chinurenico (2). Barra della scala, 2.5 pA, 25 msec. D) Esempi tracce di una corrente interna registrata in voltage-clamp (pannello inferiore) e la depolarizzazione della membrana corrispondente registrata in current-clamp (pannello superiore) indotto in un astrociti dalla stimolazione SC. Barra Scala, current-clamp 1,5 mV, voltage-clamp 5 pA, 1 sec. E) di ingresso-uscita curve che illustrano il rapporto tra la fibra raffiche presinaptico (input) e la corrente totale astrogliale (uscita) registrata contemporaneamente in risposta alla stimolazione SC (n = 6). Gli aumenti astrogliali corrente linearmente con le raffiche di fibre maggiori, come il fEPSP neuronale. F) tracce di esempio della risposta neuronale (fEPSP) e la corrente astrociti sono mostrate per paired-impulso di stimolazione ad un intervallo di 40 msec dell&#39;impulso. I sinapticamente-evocati mostre astrogliali attuali, come i neuroni, paired-pulse facilitazione. Barra della scala, 0.1 mV, 5 pA, 20 msec. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="3.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4418/4418fig3highres.jpg"/> Figura 3. Registrazioni doppie di risposte neuronali e astrogliale sinapticamente indotti nelle aree CA1 e CA3 dell&#39;ippocampo. A) Ricostruzione di una cellula piramidale CA1-iniettato con sulforodamina B (rosso, 0,1%) e un astrocita riempito con fluoresceina destrano (verde, 0,1%), utilizzando il whole-cell patch-clamp. Scala bar, 10 micron. B 1) rappresentativi di tracce simultanee di cellule intere registrazioni di potenziali di membrana registrati in current-clamp da una cella CA1 piramidale e un astrociti adiacente. Neuronale cottura potenziale d&#39;azione (nero traccia), evocato da iniezione di un PA 20 depolarizzante impulso di corrente, evoca alcuna risposta in astrociti adiacente (grigio traccia). Barra Scala, 20 mV, 10 pA, 100 msec. B 2) Esempi di tracce di due cellule intere registrazioni di una cellula piramidale CA1 in corrente-vongolap ed un astrociti vicina in voltage-clamp dopo stimolazione SC in presenza di picrotossina (100 pM). SC stimolazione evoca un potenziale postsinaptico eccitatorio (EPSP, nero traccia), associato ad una piccola corrente e duraturo astrocitica (grigio traccia). Bar Scala, 5 mV, 10 pA, 100 msec. C) Schema della fetta ippocampale raffigurante nel giro dentato (DG) e CA3 aree la disposizione degli elettrodo stimolante, per attivare le fibre muschiose, l&#39;elettrodo pipette patch (grigio), per registrare correnti astrocitari, e l&#39;elettrodo extracellulare, a Record fEPSP, evocata dalla stimolazione CA3 muschio fibre. D, E) tracce rappresentativi di registrazioni appaiati del CA3 fEPSPs (pannelli superiori, tracce nere in D 1 e D 2) e astrocitari cellule intere risposte (pannelli inferiori, tracce grigie D 1 e D 2) alla stimolazione singola CA3 muschio fibre a 0,02 Hz (zoom nel riquadro) (D 1) o ad 1 Hz di frequenza di stimolazione (D 2). Bar Scala per D <sub&gt; 1 e D 2, 0,2 mV, 15 pA, tempo: 1 sec D 1, D 2 100 msec. Scala grafica Inset, 0.1 mV, 100 msec.

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni in<em&gt; Strato radiatum</em&gt; Durante la stimolazione di Schaffer collaterali è descritto. L&#39;isolamento farmacologica di potassio astrogliale e correnti trasportatore del glutammato è dimostrata.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

dual-electrophysiological-recordings-synaptically-evoked-astroglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.1K Views.  Collège de France. La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni in Strato radiatum Durante la stimolazione di Schaffer collaterali è descritto. L'isolamento farmacologica di potassio astrogliale e correnti trasportatore del glutammato è dimostrata.

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Identified by Green Fluorescent Protein (GFP) in Hypothalamic Slices

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH). These gonadotropins are essential for the regulation of reproductive function. The GnRH-containing neurons are distributed diffusely throughout the hypothalamus and project to the median eminence where they release GnRH from their axon terminals into the hypophysiotropic portal system (1). In the portal capillaries, GnRH travels to the anterior pituitary gland to stimulate release of gonadotropins into systemic circulation. GnRH release is not continuous but rather occurs in episodic pulses. It is well established that the intermittent manner of GnRH release is essential for reproduction (2, 3).
Coordination of activity of multiple GnRH neurons probably underlies GnRH pulses. Total peptide content in GnRH neurons is approximately 1.0 pg/cell (4), of which 30% likely comprises the releasable pool. Levels of GnRH during a pulse (5, 6), suggest multiple GnRH neurons are probably involved in neurosecretion. Likewise, single unit activity extracted from hypothalamic multi-unit recordings during LH release indicates changes in activity of multiple neurons (7). The electrodes with recorded activity during LH pulses are associated with either GnRH somata or fibers (8). Therefore, at least some of this activity arises from GnRH neurons.
The mechanisms that result in synchronized firing in hypothalamic GnRH neurons are unknown. Elucidating the mechanisms that coordinate firing in GnRH neurons is a complex problem. First, the GnRH neurons are relatively few in number. In rodents, there are 800-2500 GnRH neurons. It is not clear that all GnRH neurons are involved in episodic GnRH release. Moreover, GnRH neurons are diffusely distributed (1). This has complicated our understanding of coordination of firing and has made many technical approaches intractable. We have optimized loose cell-attached recordings in current-clamp mode for the direct detection of action potentials and developed a recording approach that allows for simultaneous recordings from pairs of GnRH neurons.

Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Activity in neuronal systems often requires synchronous action potential discharges from neurons within a specific population. For example, pulses of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) likely require coordinated activity between GnRH neurons. We present our methodological approach for reliably obtaining simultaneous electrophysiological recordings from the diffusely distributed GnRH neurons.

Doppio registrazioni somatica da Gonadotropina-Releasing Hormone (GnRH) Neuroni Identificato da una proteina fluorescente verde (GFP) in fette ipotalamici

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

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Neuroscienze

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

Indagine di Synaptic Tagging / Cattura e Cross-cattura utilizzando acuta fettine di ippocampo da Roditore

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the pathophysiological basis of these diseases, it is necessary to precisely characterize in which way the processing of information is disturbed between the different neuronal parts of the circuit. Using extracellular in vivo electrophysiological recordings, it is possible to accurately delineate neuronal activity within a neuronal network. The application of this method has several advantages over alternative techniques, e.g., functional magnetic resonance imaging and calcium imaging, as it allows a unique temporal and spatial resolution and does not rely on genetically engineered organisms. However, the use of extracellular in vivo recordings is limited since it is an invasive technique that cannot be universally applied. In this article, a simple and easy to use method is presented with which it is possible to simultaneously record extracellular potentials such as local field potentials and multiunit activity at multiple sites of a network. It is detailed how a precise targeting of subcortical nuclei can be achieved using a combination of stereotactic surgery and online analysis of multi-unit recordings. Thus, it is demonstrated, how a complete network such as the hyperdirect cortico-basal ganglia loop can be studied in anesthetized animals in vivo.

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

In this study, the methodology is presented on how to perform multi-site in vivo electrophysiological recordings from the hyperdirect pathway under urethane anesthesia.

acuto<em&gt; In Vivo</em&gt; Registrazioni elettrofisiologiche dei potenziali del campo locale e dell&#39;attività multi-unità dal percorso iperdirezionale nei ratti anestetizzati

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetica trascinamenti di teta Hippocampal oscillazioni nel comportarsi topi

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.