Macchia rapida di Golgi per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale

Sebbene relativamente semplice, la tecnica di impregnazione di Golgi ha alcuni passaggi difficili e la mancata esecuzione corretta di tali calcoli si traduce in cellule inadatte all'analisi. Questa tecnica fornisce un'etichettatura rapida e riproducibile dei neuroni impregnati di Golgi. Inoltre, il piccolo errore standard della media consente il confronto tra gli esperimenti.

La parte più impegnativa di questa tecnica è il taglio delle sezioni criostatali, perché ci sono una consistenza e una fissazione insolite, e quindi portarle sulla diapositiva piatta è un po 'una sfida richiede pratica. In primo luogo, posizionare una piccola quantità di mezzo tissutale su un mandrino criostato pre-freddo. Montare i blocchi cerebrali su mandrini criostati scongelando leggermente un lato del blocco in una mano guantata e posizionandolo sul mezzo tissutale.

Utilizzare uno spray congelante sul coltello e sul blocco. Utilizzare la piastra antirollio o la spazzola per mantenere la sezione piatta durante il taglio. Tagliare sezioni di 100 micrometri su un criostato a meno 22 gradi Celsius.

Scongelare, se possibile, utilizzando una slitta a temperatura ambiente e opporla rapidamente alla sezione. In alternativa, tenere le diapositive nel criostato, in modo che si congelino. Trasferire la sezione con una pinza fredda o un pennello freddo e quindi scongelare il montaggio.

Montare tre o quattro sezioni coronali su subsides. Pulire il coltello con salviette di carta tra le fette. Se il coltello richiede un'ulteriore pulizia, utilizzare etanolo al 100% e asciugare prima di tagliare la fetta successiva.

Posizionare le diapositive in rack, distanziati abbastanza da consentire l'accesso della soluzione alle sezioni. Mettere le sezioni in acqua distillata due volte per quattro minuti prima di metterle nella soluzione di impregnazione di Golgi per 10 minuti. Separare gli slip di copertura per assicurarsi che sulle sezioni sia posizionato un solo slip di copertura.

Coprire le diapositive di vetro con una generosa quantità di mezzo di montaggio prima di posizionare una copertura di vetro scivolare sulla diapositiva. Una volta che la copertina è scivolata, i vetrini asciutti sono stati segnalati su qualsiasi carta non porosa per tre-cinque giorni, spostandoli leggermente, soprattutto dopo il primo giorno per evitare di attaccarsi. Successivamente trasferire le diapositive sui supporti per diapositive e, idealmente, asciugare le diapositive per almeno tre settimane prima di esaminarle.

Per analizzare la densità della colonna vertebrale dendritica nei neuroni piramidali sia della corteccia prefrontale mediale che della regione CA1 dell'ippocampo, misurare la lunghezza dendritica utilizzando il programma di analisi delle immagini. Conta le spine sui dendriti usando un contatore a mano e registra sia la lunghezza che il numero di spine. Per l'analisi, scegliere neuroni con corpi cellulari e dendriti mentre sono impregnati e dendriti che sono continui e distinguibili dalle cellule adiacenti.

La figura mostra esempi di cellule impregnate di Golgi nella regione CA1 dell'ippocampo è mostrato a bassa e alta potenza. La figura illustra un esperimento in cui la densità della colonna vertebrale dendritica basale è stata aumentata sulle cellule piramidali in ratti adolescenti maschi e femmine dopo arricchimento ambientale in CA1 e nella corteccia prefrontale mediale. È difficile mantenere le sezioni abbastanza fredde durante il taglio e usiamo una grande quantità di spray congelante per farlo.

E poi successivamente, è difficile ottenere le sezioni sulle diapositive e farle asciugare piatte. Questa tecnica viene utilizzata per esaminare le caratteristiche neuroanatomiche. Può essere usato da solo o in combinazione con altri metodi di tracciamento neuroanatomico.