Per iniziare, prepara l'interfaccia del peptide proteico per la diversificazione della sequenza. Apri il file PDB in chimera e assicurati che la struttura delle subunità target sia intatta senza atomi o legami mancanti. Per rimuovere tutte le molecole non essenziali dalla struttura, fare clic su Seleziona, quindi su Residuo, quindi selezionare tutte le molecole diverse dagli amminoacidi standard.
Quindi fai clic su Azioni seguito da Atomi/Legami ed elimina. Quindi, fare clic su Preferiti e Sequenza, quindi fare clic sulla catena considerata come ligando. Ritagliare la catena di leganti al segmento interagente identificato eliminando tutti i residui tranne quelli tra le posizioni selezionate.
Fare clic su File e salva PDB per salvare la struttura modificata in un file PDB diverso. Copiare questo file in un percorso Linux accessibile dalle applicazioni Rosetta. Utilizzare l'applicazione PDB fissa di Rosetta per eseguire un reimpacchettamento di tutte le catene laterali di amminoacidi della struttura di base prima della diversificazione della sequenza eseguendo questo comando.
Quindi, rinominare il file PDB ricompresso con il suffisso di reimballaggio del carattere di sottolineatura utilizzando il comando seguente. Quindi, eseguire pepspec in modalità progettazione per eseguire la diversificazione della sequenza utilizzando questo comando. Quindi, generare un pwm utilizzando il gen_pepspec_pwm.
script py incluso nella Rosetta Suite. Per eseguire questo script, utilizzare il comando seguente. Per creare un logo di sequenza, apri il file con le sequenze peptidiche generate nel passaggio precedente con l'editor di testo preferito e copia tutte le sequenze.
Passare al server del logo Web e incollare le sequenze nella casella di testo Allineamento sequenze multiple. Scegli il formato e la dimensione desiderati del logo in base alla lunghezza di input e fai clic su crea logo. Utilizzando questo protocollo, sono state previste le preferenze degli amminoacidi per il motivo pLxIS conservato nella superficie di legame di IRF5.
La posizione, la matrice di peso e il logo della sequenza generati dalla diversificazione della sequenza hanno mostrato una preferenza per il glutammato alla posizione 432 e per la leucina e l'isoleucina alle posizioni 433 e 435. Le posizioni 427, 429 e 436 tipicamente occupate dalla serina hanno mostrato una maggiore preferenza per l'aspartato e il glutammato, evidenziando il ruolo della fosforilazione e della dimerizzazione di IRF5. La posizione 425 ha mostrato un'alta preferenza per la serina, suggerendo il suo coinvolgimento nell'interazione proteina-proteina nella sua forma non fosforilata.
