Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finanziamenti GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA concessione F31AI091484, Emory CFAR concessione P30 A1050409. Questa indagine è stata condotta in una struttura costruita con il supporto di strutture di ricerca di miglioramento di Grant # C06 RR18386 dal NIH / NCRR. Le cellule Jurkat, l&#39;insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi, così come il coniglio anti-HIV-1 Nef antisiero sono stati ottenuti dal NIH AIDS Research &amp; Programma reagente di riferimento, (Rockville, MD).

I. Utilizzo di brevi peptidi in analisi biologica I.1. Mappatura Motivi Biologicamente Funzionali Peptidi <ol><li> Trattando le cellule con Nef peptidi di scansione <ol><li> Procurarsi un insieme di peptidi scansione della regione di interesse. Per i nostri esperimenti, peptidi 20mer, con 10 sovrapposizione aminoacidi, che coprono l&#39;intera HIV-1 Nef proteina (205 aa), sono stati ottenuti dal Programma reagente AIDS. I peptidi sono saggiati singolarmente come segue: </li><li> Aggiungere 10 ng / ml di peptide per mezzo di coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per piastra per colture cellulari Jurkat. </li><li> Incubare culture per 24 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediata dUTP biotina Nick End Labeling (TUNEL) saggio di apoptosi <ol><li> Lavare le cellule con 1X PBS, e fissare per 30 min a temperatura ambiente con 4% paraformaldeide in 1X PBS, pH 7,4. </li><li> Lavare con 1X PBS, e permeabilize con 0,1% Triton X-100 per 10min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS 1X. </li><li> Contare le cellule colorate con epifluorescenza su un sistema di microscopia controllato dal computer. </li></ol></li></ol> I.2. Analisi inibizione competitiva utilizzando peptidi <ol><li> La co-trasfezione di peptidi utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti <ol><li> Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 100 ng di tipo selvatico sia peptidi derivati ​​dal dominio SMR, o peptidi contenenti alanina-sostituzioni di singoli aminoacidi nel motivo SMR, ad un volume finale di 100 microlitri con 1X PBS. </li><li> Diluire 6 pl di una diluizione di Chariot Reagente 1/10 ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e si combinano con la miscela diluita DNA-peptide. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-peptide. </li><li> Pellet 3 x 10 5 cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere nel complesso Chariot / DNA-peptide. </li><li> Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare le cellule in piastre di coltura a 37 ° C per 2 h. </li><li> Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C. </li><li> Celle di raccolta e di determinare l&#39;efficienza di trasfezione mediante microscopia a fluorescenza. </li></ol></li><li> Nef-GFP secrezione fluorescente piatto saggio lettore di inibizione peptide <ol><li> Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero. </li><li> Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d&#39;onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d&#39;onda di emissione in unità fluorescenti relativi. </li><li> Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e un strapazzate peptide) A 100%. </li><li> Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con vari peptidi SMR per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP. </li></ol></li></ol> I.3. Isolando Motif Partners associazione utilizzando peptidi come esca <ol><li> Co-immunoprecipitazione con peptidi SMR <ol><li> Coltivare le cellule Jurkat in RPMI 1640 contenente 10% FBS a 37 ° C in un pallone di coltura tissutale T-75, e le cellule pellet per centrifugazione a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. Determinare l&#39;efficienza di trasfezione, collocando la lastra sotto un microscopio a fluorescenza, acquisire immagini, e successivamente contare le cellule totali etichettati e determinare le cellule marcate cento. </li><li> Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di PBS 1X, e trasferirlo in una provetta Eppendorf da 1,5 ml. Microcentrifuga a 1.000 xg per 1 min. Risospendere il pellet in 1 ml di α-FLAG tampone di lisi per pipettaggio delicato. Tampone di lisi: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7.4, 150 mM sodio chloride [NaCl], 1 mM EDTA, e 1% Triton X-100, con 1 mM PMSF [PMSF], e 10 microlitri / ml di cocktail inibitore di proteasi per uso con cellule di mammifero ed estratti tissutali [PIC; Sigma]. Fai subito prima dell&#39;uso. </li><li> Differenzialmente microcentrifuga le sospensioni a 2.000 xg per 5 min, e a 13.000 xg per 10 min a pellet i detriti cellulari e il DNA, rispettivamente. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la &quot;lisato&quot;). </li><li> Aggiungere 1 mg di proteina lisato e 1 mg sia del SMRwt o SMRmut peptide di 20 l di anti-FLAG M2 Affinity Gel (qui di seguito denominata &quot;resina&quot;, Sigma). Si noti che sia SMRwt e SMRmut usato qui hanno una sequenza di tag bandiera incorporata nei peptidi. Portare la miscela a un volume finale di 1 ml in tampone Co-IP (α-FLAG Lysis buffer meno PMSF e PIC). Incubare la miscela a 4 ° C per una notte con rotazione end-over-end. Come controllo negativo, incubare il lisato con la resina in assenza di entrambi peptide. </li><li> Pellet resina mediante microcentrifugation a 5000 - 8000 xg per 30 sec. Lasciare resina riposare per 2 minuti prima di maneggiare il campione e poi aspirare il surnatante. Rimuovere il surnatante con una pipetta stretta-end, o una siringa Hamilton, facendo attenzione a non trasferire la resina. Puntali Narrow-end possono essere effettuate utilizzando pinze per pizzicare l&#39;apertura di un puntale di plastica fino a quando non viene parzialmente chiusa. Lavare la resina quattro volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio (50 mM Tris HCl pH 7,4 •, e 150 mM NaCl). Eluire le proteine ​​cellulari associate con 15 pg di peptide FLAG 3X (Sigma) in 50 ml di tampone di lavaggio e incubare a bilico / agitatore per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Concentrare gli eluati per precipitazione acetone, seguito da bollire in tampone Laemmli (Bio-Rad). Separare le proteine ​​mediante SDS-PAGE su un 4-20% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Macchiare il gel con Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Nota: per gli esperimenti di identificazione di spettrometria di massa ( <strong&gt; Figura 4A), ciascuna condizione (Co-IP con SMRwt, SMRmut, o nessun peptide) è stata eseguita in quadruplicato, e gli eluati da tutti quattro repliche sono stati raccolti insieme prima di acetone precipitazione per un totale di 4 mg di proteina totale immessa / condizione). </li></ol></li><li> Co-immunoprecipitazione con proteina Nef-GFP <ol><li> Mescolare 50 ml di proteina G Dynabeads sfere magnetiche (Invitrogen) con 2 pg di anticorpo monoclonale murino anti-GFP in 1 ml di 1X PBS con 0,02% di Tween 20 (PBS-T). Incubare la miscela con rotazione end-over-end in una provetta Eppendorf da 1,5 ml per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Separare le perline dal buffer ponendo la provetta in un 1,5 ml Magnasphere Tecnologia basamento separazione magnetica (Promega Corp., Madison, WI) permettendo pulldown magnetica seguita dalla rimozione del supernatante. Lavare le perline rivestite anti-GFP con 1 ml di PBS-T utilizzando pipettaggio delicato. </li><li> Lyse Nef-GFP cellule Jurkat trasfettate con 1 ml di 1X RIPA + tampone pipettando dolce e incubazione per 15 min su ghiaccio. RIPA + buffer: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 diluita in acqua sterile, 0,02% di sodio azide [sigma], e il 0,1% di sodio dodecil solfato [SDS], con 1 mM PMSF e 10 microlitri / ml PIC aggiunto immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Pellet i detriti cellulari da microcentrifugation a 2.000 xg per 10 min. Raccogliere il surnatante (qui di seguito denominata la &quot;lisato&quot;). </li><li> Aggiungere 1 mg di proteina lisato alle perline rivestite di anti-GFP, portare il volume finale di 1 ml con 1X tampone RIPA +, ed incubare la miscela con rotazione end-over-end per 1 ora a 4 ° C. Nota: Per gli studi di peptide concorrenza, 1 mg di proteina lisato può essere pre-incubate con 2 mg di SMRwt o SMRmut peptide in 1 ml di 1X RIPA + tampone, prima di essere aggiunti alle perle rivestite anti-GFP. </li><li> Lavare le perline mediante risospensione in 1 ml di tampone di lavaggio (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% di Tween 20). Incubare con rotazione end-over-end per 5 minuti a 4 ° C. Separare le perline from il lavaggio con il supporto separazione magnetica. Lavare le perle di una seconda e terza volta con tamponi di lavaggio contenenti 250 mM e 300 mM di NaCl, rispettivamente. </li><li> Risospendere le sfere in 200 microlitri di PBS, trasferire la miscela in una provetta pulita, e separare le perline dal lavaggio sul supporto magnetico. Lessate le perline in 50 ml di campione Laemmli buffer di 5 min a 95 ° C, lasciare raffreddare il composto per 10 minuti a temperatura ambiente, e poi mettere il composto sul supporto magnetico per la separazione, e raccogliere il surnatante (&quot;eluati&quot;) . </li><li> Separare le proteine ​​del eluato da SDS-PAGE su un Tris-HCl Criterion gel prefabbricato 8-16%. </li></ol></li><li> Spettrometria di massa <ol><li> Accise le bande proteiche di interesse dal gel Coomassie macchiati. </li><li> Ridurre i campioni in 10 mM 1,4-ditiotreitolo (DTT) per 45 min a 37 ° C. </li><li> Alchilata i campioni a 55 mm iodoacetamide per 45 min a 25 ° C. </li><li> Digerire i campioni durante la notte con il sequenziamento tentativo di gradoPSIN (Promega) a 37 ° C. </li><li> Desalt i peptidi di esempio con C-18 ZipTip (Millipore). Mescolare i peptidi del campione con alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e individuarli su una MTP bersaglio telaio III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA). </li><li> Eseguire tandem laser desorbimento / ionizzazione volta assistita dalla matrice di volo (MALDI-TOF/TOF) spettrometria di massa utilizzando un Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF. </li><li> Confrontare i dati MS / MS per i database non ridondanti e Swiss-Prot NCBI utilizzando l&#39;algoritmo di Mascot ( <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ). </li></ol></li><li> Immunoblot analisi <ol><li> Separare i campioni di proteine ​​mediante SDS-PAGE il 4-20% o 8-16% Tris-HCl Criterion prefabbricati gel (Bio-Rad). Trasferire le bande elettroforesi su una membrana di nitrocellulosa. </li><li> Lavare la membrana in soluzione salina tamponata Tris (TBS, Bio-Rad) per 5 min. Bloccare con il 5% di latte scremato in TTBS (TBS con il 0,1% di Tween 20) per 1 ora agitando a temperatura ambiente. </li><li> Elaborare la membrana per immunoblotting usando uno specifico anticorpo primario in 5% di latte scremato in agitazione a 4 ° C durante la notte. Lavare in TTBS per 20 min seguito da un coniugato HRP IgG (H + L) anticorpo secondario in 5% di latte scremato per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare in TTBS per 30-60 min. </li><li> Rileva le bande di proteine ​​mediante Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Esporre il filtro a pellicola fotografica. Nota: In alcuni esperimenti, un reagente di strippaggio è stato utilizzato per striscia la membrana (Pierce, Rockford, IL) con successiva ibridazione con un anticorpo primario e secondario diverso. </li><li> Eseguire la scansione delle pellicole radiografiche in Adobe Photoshop 5.0.2. Eseguire l&#39;analisi densitometrica utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li></ol> II. L&#39;uso di anticorpi Inibizione in Analisi Funzionale II.1. La co-trasfezione di anticorpiIES utilizzando il Carro Protein consegna kit reagenti <ol><li> Per ogni miscela di reazione di trasfezione, diluire 1 pg di wtNef-GFP DNA plasmidico e 1 mg di anticorpo anti-sia mortalin o anti-α-tubulina anticorpo, per un volume finale di 100 microlitri di PBS 1X. Nota: Precedentemente scoperto che la co-trasfezione del anticorpo anti-α-tubulina ha alcun effetto rilevabile sulla secrezione exNef, e, quindi, serve come un efficace controllo negativo in questi esperimenti. </li><li> Diluire 6 pl di reagente non diluito Chariot ad un volume finale di 100 microlitri di acqua sterile, e combinare con la miscela di DNA-anticorpo diluito. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione del Carro / complesso DNA-anticorpo. </li><li> Pellet 3 x 10 5 cellule Jurkat per centrifugazione a 600 xg per 5 min. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS 1X e risospendere in Chariot / complesso DNA-anticorpo. </li><li> Aggiungere 400 microlitri di siero terreno RPMI 1640 alla sospensione e incubare la cells in piastre di coltura a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 1 ml di fresco RPMI 1640 contenente 10% FBS per ciascuna piastra, e incubare le cellule per 48 ore a 37 ° C. </li></ol> II.2. Nef-GFP secrezione Fluorescente Piastra Reader Saggio di anticorpo Inibizione <ol><li> Raccogliere i media condizionata, privi di cellule dalle cellule raccolte, e trasferire 100 ul a singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero. </li><li> Misura fluorescenza GFP nei media su un Tecan GENEios fluorimetro con lunghezza d&#39;onda di eccitazione 485 nm e 515 nm di lunghezza d&#39;onda di emissione in unità fluorescenti relativi. </li><li> Impostare il livello di fluorescenza GFP nel controllo (supporti da cellule co-trasfettate con Nef-GFP e anti-α-tubulina anticorpo) a 100%. </li><li> Confrontare questo al livello di fluorescenza GFP nei media dalle cellule co-trasfettate con anticorpo anti-mortalin per determinare cambiamenti nella secrezione Nef-GFP. </li></ol>

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Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).</li><li>Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+the+signalling+and+antiviral+properties+of+SDF-1-derived+small+peptides.">Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides.</a> Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).</li><li>Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMR-derived+peptide+disrupts+HIV-1+Nef's+interaction+with+mortalin+and+blocks+virus+and+Nef+exosome+release.">SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release.</a> J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).</li><li>Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cataloguing+the+HIV+type+1+human+protein+interaction+network.">Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).</li><li>Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+nef+gene+sequences+present+in+vivo.">Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo.</a> J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. L&#39;inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire la deplezione delle cellule T CD4 e della CIA che guidano l&#39;HIV / AIDS patogenesi. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare le proteine ​​cel...

Con l&#39;avvento della terapia antiretrovirale, l&#39;epidemia di AIDS nel mondo occidentale è stato rallentato, ma non ridotto, e la diffusione di HIV continua ad essere un grave problema di salute in tutto il mondo. Con l&#39;eccezione del marginalmente efficace prova RV144 Thai, vaccini contro l&#39;HIV hanno finora dimostrato incapacità di proteggere dalle infezioni. Così, la ricerca di ulteriori potenziali bersagli terapeutici, è ancora giustificata. Insieme con CD4 deplezione delle cellule T, persistente attivazione immunitaria generalizzata è un marchio di garanzia di infezione da HIV. L&#39;attivazione immunitaria cronica (CIA) implica un miglioramento della turnover cellulare, sottopopolazioni linfocitarie attivate e differenziate, stanchezza e la senescenza cellulare, e l&#39;uccisione delle cellule T e le cellule B mediante l&#39;attivazione indotta Cell Death (AICD) 1,2,3, e esso è ben definito come uno dei più forti predittori di progressione della malattia 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Tuttavia, i meccanismi alla base della CIA e CD4Deplezione di infezione da HIV delle cellule T devono ancora essere completamente chiarito. La prova dal nostro laboratorio e altri ci ha portato a un modello di progressione della malattia (Figura 1) in cui la proteina Nef di HIV (fattore di regolazione negativa) induce la secrezione di exosomes da HIV-1 le cellule infette 13,14. Questi exosomes Nef contenenti (exNef) inducono apoptosi in un certo numero di linee cellulari tra cui cellule CD4 non infetti le cellule T 15,16. In alternativa, nei monociti / macrofagi exNef altera i pattern di espressione genica, ad esempio, l&#39;espressione di citochine, e sembra indurre uno stato di attivazione del sistema immunitario non in programma. Questo corpo di evidenza suggerisce un ruolo importante per exNef nella CIA e CD4 deplezione delle cellule T. La comprensione dei meccanismi alla base della capacità di Nef di manipolare il percorso traffico exosomal sarà utile in nuovi inibitori di ingegneria di secrezione exNef. Inibizione della secrezione exNef dovrebbe diminuire il CD4 deplezione di cellule Te la CIA che guidano l&#39;HIV / AIDS patogenesi. Per raccogliere le prove che hanno portato il nostro modello di progressione della malattia da HIV / AIDS ei dati successivi che hanno costruito su questo modello, abbiamo sviluppato una serie di nuovi reagenti e delle metodologie che ci ha permesso di analizzare la genetica di secrezione exNef, e cominciamo a determinare la proteine ​​cellulari coinvolte. Nel lavoro iniziale, abbiamo scoperto che la proteina Nef induce apoptosi nelle cellule bystander extracellulare e viene rilasciato dalle cellule transfettate Nef e HIV-infetti 15. Peptidi derivati ​​da (cellula stromale Derived Factor-1, con l&#39;alfa splicing alternativo) SDF-1α erano stati precedentemente dimostrato di mantenere gran parte della attività di legame e segnalazione della molecola intera lunghezza 17. Abbiamo ipotizzato che i peptidi di Nef potrebbero mantenere alcune delle attività apoptotica della proteina integrale, e che questi peptidi sarebbero necessariamente contenere il dominio apoptotico Nef (s). Per identificare questi peptidi, e di conseguenza la Nefdominio apoptotica (s), si ottiene un insieme di 20 HIV-1 Nef peptidi scansione dal AIDS Research NIH e Programma reagente di riferimento. Questi peptidi 20-AA, ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, prendono il nome dal numero del loro ultimo aminoacido, cioè N20 campate Nef aminoacidi 1-20, N30 campate Nef aminoacidi 11-30, ecc 16. Abbiamo trovato che esponendo cellule T extracellulare di peptidi specifici sovrapposti due domini distinti 10-aa nella proteina Nef intera lunghezza apoptosi indotta in queste cellule. Successiva analisi di questi peptidi apoptotici Nef-derivati ​​rivelato la loro capacità di interagire fisicamente con il recettore della chemochina CXCR4 sulla superficie delle cellule T, con cinetiche di legame che permettevano questi peptidi di inibire competitivamente vincolante tra CXCR4 e il suo ligando naturale SDF-1α. Infine, l&#39;interazione dei peptidi derivati ​​Nef-apoptotiche &#39;con CXCR4 è stato trovato per indurre una risposta allo stress in queste T-cellule portano all&#39;apoptosi. Questa prova ci ha permesso di Quicdomini funzionali di kly mappa Nef, un processo che avrebbe richiesto molto più tempo utilizzando tecniche di mutagenesi del DNA standard, quali alanina scansione mutagenesi. Essa ha anche mostrato che questi peptidi corti Nef-derivati ​​mantenuti la funzione biologica dei domini apoptotici nella proteina intera. Dopo aver identificato un ruolo per Nef extracellulare, cioè l&#39;apoptosi delle cellule T, abbiamo cercato una migliore comprensione di come Nef è stato secreto dalle cellule. Utilizzando una serie di costrutti Nef mutati, abbiamo mappato altamente conservate motivi proteine ​​Nef nelle regioni N-terminali di entrambi HIV Nef, e il suo macaco Rhesus equivalente mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, che sono fondamentali per exNef secrezione 13. Uno di questi motivi, la modifica Regione secrezione (SMR; 66VGFPV70), è stato particolarmente critico, come la sostituzione di alanina di uno dei suoi cinque aminoacidi sia notevolmente ridotto o abolito secrezione exNef. Quando consegnato alle cellule tramite del Soggetto attivo CHariot proteine ​​reagenti di consegna, un peptide contenente la SMR attaccato ad una sequenza peptidica FLAG (SMRwt) è stato trovato per inibire la secrezione exNef sia da Nef transfettate e infezione da HIV cellule 18. Sulla base della nostra esperienza precedente con i peptidi, abbiamo deciso di utilizzare questo peptide per chiarire le molecole ei meccanismi alla base del ruolo della Nef SMR nella secrezione exNef. Usando il peptide SMRwt come il nostro &quot;proteina esca&quot;, abbiamo co-immunoprecipitata cellulari partner di legame degli SMR non infetti da lisati di cellule T 18. La sequenza del peptide FLAG disponibile una comoda maniglia per catturare il peptide SMRwt utilizzando anticorpi anti-FLAG resina di affinità. La nostra precedente scoperta che un singolo valina per alanina mutazione del peptide SMRwt era sufficiente per eliminare la sua inibizione della secrezione exNef identificato una comoda, peptide di controllo altamente specifico (SMRmut) che abbiamo usato per escludere le proteine ​​co-immunoprecipitate non specifici per l&#39;SMR. Utilizzando un peptide con la sdominio pecific di interesse piuttosto che la proteina full-length ci ha permesso di bypassare la proiezione di decine di fattori cellulari che si legano ad altri domini in Nef 19. Una volta che abbiamo identificato i partner SMR vincolanti, un passo logico successivo è stato quello di dimostrare che i partner di legame cellulari individuati sono importanti per la funzione biologica 18. La procedura standard per farlo è a livelli proteici knockdown utilizzando miRNA proteina bersaglio-specifici o siRNA, e successivamente il dosaggio effetto sulla funzione biologica. Abbiamo effettuato miRNA smontabile, che inibisce traduzione del mRNA bersaglio, riducendo la produzione di tale obiettivo, in questo caso una proteina SMR-binding. Questa riduzione della proteina bersaglio è un effetto indiretto, e possibilmente ha un effetto ritardato sulla funzione biologica della proteina mirata svolge un ruolo pollici conseguenza, abbiamo anche impiegato la tecnica inibizione anticorpo meno comune per determinare se interrompere direttamente l&#39;attività deila proteina bersaglio riduce o elimina la funzione biologica. In questa procedura, anticorpi contro la proteina mirati sono trasfettate nella cella usando Carro reagente, e interagire direttamente con la proteina bersaglio o sequestrare dal suo sito di funzione, o bloccando la sua rilevante dominio di legame. Inibizione della proteina bersaglio attraverso questa procedura interrompe direttamente la sua funzione, e può integrare procedure abbattibili RNA confermando ulteriormente l&#39;importanza della proteina bersaglio per la funzione biologica. Mentre Chariot reagente è efficace a fornire peptidi e proteine ​​nelle cellule, questo processo richiede tempo e limita i tipi di esperimenti, ad esempio, esposizioni prolungate o ripetute e in studi su animali in vivo, che può essere eseguita. Di conseguenza, abbiamo aggiunto un peptide (CPP) sequenza di celle-penetrante al SMRwt peptide (SMRwt-CPP) 18 per generare un peptide che potrebbe essere assorbita dalle cellule passivamentedai mezzi di coltura. Questa versione è risultato efficace quanto il primo a secrezione exNef inibizione. L&#39;evidenza da questi esperimenti pubblicati dimostra la capacità di piccoli peptidi contenenti specifici motivi funzionali di antagonizzare la funzione della proteina intera per inibizione competitiva, e per isolare le proteine ​​che legano questi motivi. Ci si aspetterebbe che queste tecniche dovrebbero essere utili in molti protocolli sperimentali. Essi dovrebbero anche essere efficace in ingegneria nuovi inibitori peptidici di molti processi cellulari, una funzione che può essere ulteriormente migliorato legame a sequenze CPP.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Brevi peptidi specifici derivati ​​da motivi trovati nelle proteine ​​integrali, nel nostro caso di HIV-1 Nef, conservano non solo la loro funzione biologica, ma possono anche inibire competitivamente la funzione della proteina intera. Un insieme di 20 Nef peptidi di scansione, 20 aminoacidi di lunghezza con ogni sovrapposizione di 10 amminoacidi del suo vicino di casa, sono stati utilizzati per identificare i motivi in ​​Nef responsabile per la sua induzione di apoptosi. Peptidi contenenti tali motivi apoptotico indotto apoptosi a livelli comparabili alla proteina Nef intera lunghezza. Un secondo peptide, derivato dal Modification Regione secrezione (SMR) della Nef, ha mantenuto la capacità di interagire con le proteine ​​cellulari coinvolte nella secrezione di Nef in exosomes (exNef). Questo peptide SMRwt stata utilizzata come proteina &quot;esca&quot; in esperimenti di co-immunoprecipitazione per isolare proteine ​​cellulari che si legano specificamente alla SMR motivo di Nef. Proteina trasfezione e anticorpo inibizione è stato utilizzato per interrompere fisicamente la scommessa interazioneween Nef e mortalin, una delle proteine ​​SMR vincolanti isolate, e l&#39;effetto è stato misurato con un test di secrezione exNef fluorescente-based. La capacità del peptide di SMRwt outcompete full-length Nef per le proteine ​​cellulari che legano il motivo SMR, ne fanno il primo inibitore della secrezione exNef. Così, impiegando le tecniche descritte qui, che utilizzano le proprietà uniche di brevi peptidi specifici derivati ​​da motivi trovati nelle proteine ​​integrali, si può accelerare l&#39;identificazione di motivi funzionali nelle proteine ​​e lo sviluppo di inibitori basati sul peptide di funzioni patogeni.

Mappatura Motivi biologicamente funzionale utilizzando peptidi. Due regioni sono state identificate sulle proteine ​​Nef che inducono l&#39;apoptosi. Apoptosi Peptide-driven è stato osservato (Figura 2) che inizia con peptide N50 (AA30-50), con un picco a N60 (AA40-60) e N70 (AA50-70), e la diminuzione di livelli di fondo di peptide N100 (aa80-100). Il principale Motif 1 (M1) di picco, centratura su AA50-60, induce&gt; 80% dei livelli apoptotici della proteina Nef intera lunghezza....

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Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners | Immunology and Infection | Video

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

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12.3K Views.  Morehouse School of Medicine. Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Metodo di particelle agglutinazione per l&#39;identificazione Poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

A seguito in tempo reale l&#39;impatto dei fattori di virulenza pneumococco in un acuto mouse Polmonite modello tramite batteri bioluminescenti

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identificazione di sequenze di localizzazione Plasmodesmal in proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Saggi per il tasso di crescita specifico e la capacità di cella-associazione di Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...