Per iniziare, posiziona il topo femmina sperimentale su una piattaforma di lavoro. Per via intraperitoneale, somministrare 7,5 unità internazionali di gonadotropina sierica di cavalla gravida intorno alle 20:00 del primo giorno. Dopo 48 ore, iniettare per via intraperitoneale 7,5 unità internazionali di gonadotropina corionica umana.
Dividere il coperchio di una piastra per colture cellulari nelle metà superiore e inferiore. Nella metà superiore, posizionare da quattro a sei goccioline da cinque microlitri ciascuna di PVP per il posizionamento dello sperma. Aggiungere da 8 a 10 goccioline da cinque microlitri ciascuna di terreno M2 nella metà inferiore per la procedura ICSI.
Coprire le goccioline medie PVP e M2 con circa tre millilitri di olio minerale. Dopo aver isolato la cauda epididimale, dal topo maschio soppresso, tamponarla delicatamente su una garza sterilizzata. Aprire la cauda epididimo e strizzarla delicatamente, usando una pinza per rilasciare gli spermatozoi, raccogliendoli in tubi di liquido tubarico umano pre-equilibrati.
Sciacquare l'epididimo della cauda nel fluido tubarico umano preriscaldato. Posizionare il tubo scoperto a 37 gradi Celsius e l'incubatore al 5% di anidride carbonica per la capacitazione degli spermatozoi. Il quarto giorno dopo l'iniezione di gonadotropina corionica umana, porre la femmina di topo soppressa sotto un microscopio da dissezione.
Utilizzando un ago calibro 25, aprire l'ampolla dell'ovidotto per rilasciare numerosi complessi di ovociti cumuliformi. Dopo la capacitazione, sonicare 100 microlitri di spermatozoo per cinque secondi per separare le teste dalle code. Riempire l'ago di micromanipolazione con il fluido operativo, assicurandosi che la porzione riempita misuri 0,5 centimetri all'interno dell'ago.
Installare l'ago sul braccio destro del micromanipolatore e fissarlo serrando il cappuccio di fissaggio. Quindi installare una pipetta di tenuta per micromanipolazione a punta piatta sul braccio sinistro del micromanipolatore. Posizionare l'ago per iniezione e la pipetta di mantenimento nel campo visivo del microscopio.
Al microscopio a polarizzazione, determinare la posizione del fuso in metafase all'interno dell'ovocita per assicurarsi che l'apparato del fuso non si trovi sul lato dell'iniezione. Al contatto dell'ago per iniezione con la zona pellucida, attivare gli impulsi piezoelettrici con un'intensità di cinque e una frequenza di uno, creando una perforazione nella zona pellucida e consentendo il passaggio dell'ago per iniezione. Utilizzando impulsi piezoelettrici di intensità uno e frequenza uno, creare un piccolo poro nella membrana plasmatica, assicurando che la testa dello spermatozoo venga iniettata nell'ooplasma.
Usando una pinza atraumatica, esteriorizza attentamente le ovaie, gli ovidotti e l'utero dalla topolina femmina anestetizzata pseudo-gravida. Praticare una piccola incisione angolata verso l'alto usando la punta di un ago da siringa sulla parete uterina sotto la giunzione uterotubarica, evitando i vasi sanguigni. Inserire delicatamente l'ovidotto di due o tre millimetri attraverso il piccolo foro.
Utilizzando il metodo ICSI, è stato raggiunto un tasso di fecondazione dell'89,57% nei topi, con l'87,38% degli zigoti che avanza allo stadio embrionale a 2 cellule entro 24 ore dopo l'ICSI. Il tasso di natalità dei cuccioli vivi dopo il trasferimento dell'embrione è stato osservato al 42,5%Non c'è stata alcuna fluttuazione significativa nei livelli casuali di glucosio nel sangue tra i topi nati naturalmente e i topi ICSI. Tuttavia, i topi maschi ICSI hanno costantemente mostrato livelli elevati di glucosio nel sangue a digiuno, suggerendo una compromissione dell'omeostasi del glucosio.
Nei test di tolleranza al glucosio, sono state osservate differenze significative nei livelli di glucosio nel sangue tra i maschi ICSI e i topi di controllo, mentre non è stata osservata alcuna differenza nelle femmine. Nel monitoraggio del peso corporeo, sia i topi ICSI maschi che le femmine hanno mostrato un fenotipo di sovrappeso rispetto ai controlli.
