Questo lavoro è stato finanziato dall'agenzia di promozione di ricerca austriaco (FFG; numero di progetto 850681), la University of Applied Sciences superiore Austria base Funding initiative (progetto GlucoSTAR) e il centro per l'innovazione tecnologica in medicina (TIMed Center) che riceve il finanziamento base di provincia dell'Alta Austria.

Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico.
1. conservazione e allevamento delle uova
<ol><li>Ottenere le uova di gallina fecondate (Tabella materiali) da un allevatore locale. Nota: Uova possono essere conservate a 14 ° C in atmosfera umidificata per fino a 10 giorni dopo la posa prima dell'uso per gli esperimenti.</li>
	<li>Incubare le uova a 38 ° C con un'umidità media del 40-60% per 10 o 11 giorni in un'incubatrice che trasforma costantemente le uova.</li>
</ol>2. selezione delle uova
<ol><li>Controllare le uova per la fecondazione dopo incubazione di fino a 11 giorni. Utilizzare una luce speratura per questo passaggio. Immergere la frangia della lampada speratura in un inkpad e candela il lato aguzzo dell'uovo.</li>
	<li>Per identificare la vescica di aria, controllare per differenze di luminosità sulla parte superiore l'uovo. Nota: La vescica di aria appare come una regione rotonda, più trasparente, mentre l'albume è più scura quando l'uovo è temperatura.</li>
	<li>Dopo il rilevamento della vescica aria, segnare la posizione premendo la lampada leggermente contro l'uovo con l'inchiostro applicato in precedenza.</li>
	<li>Escludere le uova non fecondate a questo punto, che non mostrano una differenza di luminosità tra l'albume e la vescica di aria.</li>
</ol>3. iniezione di sostanze
<ol><li>Preparare la sostanza di interesse (ad es., l'Estratto di erbe o insulina) diluendo la sostanza della concentrazione desiderata nel buffer di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank. Ad esempio, 3.3 U/mL di un'analogico in HBSS di insulina disponibile in commercio.</li>
	<li>Per l'applicazione del composto selezionato, attentamente beccare il guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette in zona marcata della vescica aria. Non fanno un buco più grande del diametro dell'ago della siringa. Iniettare la soluzione tampone (300 µ l) contenenti la sostanza di interesse nell'area pecked tramite una siringa. Nota: Utilizzare siringhe monouso sterile, 1 ml, puntali per pipette e vasi. Indossare guanti e un camice da laboratorio per gli esperimenti.</li>
	<li>Per determinare l'effetto di riduzione del glucosio nel sangue di una sostanza, mettere le uova in incubatrice per 60, 120 e 180 min, rispettivamente. Per determinare i livelli della glicemia basale, includere almeno 10-15 uova di controllo non trattato.</li>
</ol>4. prove di tossicità per
<ol><li>Dopo l'applicazione del composto selezionato per 24 h, equilibrare la membrana guscio d'uovo con tampone di fosfato (PBS) soluzione salina tamponata (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo) per almeno 30 s.</li>
	<li>Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.</li>
	<li>Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.</li>
	<li>Controllare i vasi sanguigni per lesioni e confermare la vitalità (ad es., movimento) di embrione di pollo. Nota: Vedere la Figura 1 per il confronto di vitale contro gli embrioni non vitali dopo l'applicazione di un Estratto di erbe tossico.</li>
</ol>5. misurazione del valore di glucosio del sangue
<ol><li>Presso il punto di tempo rispettivo, è attentamente rimuovere il guscio d'uovo sopra la vescica di aria ed equilibrare la membrana guscio d'uovo con il tampone PBS (sufficiente a coprire la membrana intero guscio d'uovo).</li>
	<li>Rimuovere il tampone PBS in eccesso versandolo distanza.</li>
	<li>Staccare con cautela la membrana guscio d'uovo con un aguzzo paio di pinzette.</li>
	<li>Tagliare e rimuovere la membrana corio-allantoidea con una micro-forbice, per consentire il buon accesso ai vasi sanguigni adatti. Tagliate la membrana almeno 2-3 cm. Non tagliare qualsiasi grandi imbarcazioni nella membrana stessa per evitare la perdita di sangue indesiderate dell'embrione.</li>
	<li>Individuare la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione. Sollevare questo vaso fuori l'albume con una micro-forbice chiusa e posizionarlo su una striscia di plastica pH. Spostare la striscia di pH sotto la nave, che si tiene con il micro-forbice, e tirare indietro la micro-scissor distanza attentamente.</li>
	<li>Rimuovere 1-2 mL di liquido sotto la membrana corio-allantoidea con una pipetta per evitare la diluizione del sangue nel passaggio successivo. Asciugare il vaso e il nastro di pH con carta da filtro, prima che la nave è tagliata.</li>
	<li>Tagliare il vaso sanguigno con attenzione con un micro-forbice su un lato. Non tagliare completamente la nave. Nota: La nave è spessa circa 1 mm. Non tagliare più della metà della nave per evitare di tagliare attraverso il vaso interamente, come può scivolare fuori dalla strip e nessun prelievo di sangue è possibile.</li>
	<li>Raccogliere il sangue colante da pH-strip utilizzando una pipetta. Dieci microlitri di sangue sono necessari per determinare i livelli di glucosio utilizzando il misuratore di glucosio nel sangue.</li>
</ol>6. valutazione statistica
<ol><li>Calcolare il valore medio di almeno 10 uova individuali al punto temporale e normalizzare questi valori tra i controllo ovociti (non o tampone trattato).</li>
	<li>Successivamente, determinare la percentuale di diminuzione. Inoltre, è possibile utilizzare l'insulina come controllo positivo. Nota: Ripetere ogni esperimento almeno tre volte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet:+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus.">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li><li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus.">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li><li>Han Cho, N., Cavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IDF Diabetes Atlas. 7, (2015).</li><li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes.">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes &amp; vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li><li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Medications+as+Monotherapy+or+Metformin-Based+Combination+Therapy+for+Type+2+Diabetes:+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis.">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li><li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Advances+in+the+Biochemical+and+Physiological+Aspects+of+the+Treatment+of+Type+2+Diabetes+Mellitus+with+Thiazolidinediones.">Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones.</a> PPAR research. , 7614270 (2016).</li><li>Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+antihyperglycemic+prescribing+trends+for+US+privately+insured+patients+with+type+2+diabetes.">Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).</li><li>Desai, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus:+quality+and+cost+implications.">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li><li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms.">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li><li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy.">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li><li>Onur, S., St&#246;ckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., D&#246;ring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Extract+Collection+Kiel+in+Schleswig-Holstein+(PECKISH)+Is+an+Open+Access+Screening+Library.">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li><li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gluc-HET,+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds.">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788 (2017).</li><li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts.">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109 (2016).</li><li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applicability+and+robustness+of+the+hen's+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+(HET-MN):+results+from+an+inter-laboratory+trial.">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li><li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryotoxicity+of+mirtazapine:+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test.">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, 8-10 (2010).</li><li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis.">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li><li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin.">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological &amp; pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li><li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+new+methodological+aspects+of+the+hen's+egg+test+for+micronucleus+induction+(HET-MN).">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il dosaggio di HET-CAM è un sistema ampiamente utilizzato test alternativi alla sperimentazione animale nel settore12. Il sistema di in-ovo descritto qui rappresenta una versione modificata del test HET-CAM. Mentre nella sua forma originale, HET-CAM sono esperimenti per studiare le proprietà irritanti di composti e formulazione o l'analisi di angiogenesi14,15,16, abbiamo adattato l'approccio alla prova composti con caratteristiche insulino-mimetici putativo12. Secondo la direttiva 2010/63/UE, esperimenti con embrioni aviari non-covato durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non bisogno del permesso da un comitato etico poiché questi esperimenti non sono considerati gli esperimenti sugli animali. Recenti studi hanno dimostrato l'idoneità del sistema in-ovo per caratterizzare l'efficacia di estratti di erbe selezionati, che sono state identificate in un schermo primario basate su GLUT4-traslocazione10, per ridurre i livelli della glicemia nella assenza di insulina12,13. Punti critici per una buona prestazione del sistema in-ovo comprendono: primo, un allevatore affidabile consegnare le uova fecondate. Il pollo marrone classico Lohmann è una buona scelta di razza. In secondo luogo, l'attuazione di tossicità test per escludere effetti tossici delle esigenze composti studiati per essere fatto. Inoltre, la preparazione di un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue è importante. È importante evitare il taglio di grandi vasi nella membrana corio-allantoidea stesso, come questo può portare a una perdita non-preferibile di sangue. Inoltre, prima che la nave è tagliata sulla striscia di pH, deve essere picchiettata asciutto utilizzando carta da filtro per evitare la diluizione del sangue raccolto. Infine, un numero sufficiente di esperimenti sembra essere importante. Si consiglia di utilizzare almeno 10 uova per ciascun punto di tempo e una triplice ripetizione dell'esperimento rispettivo.
Naturalmente, ci sono alcune limitazioni di questo approccio in ovo . Dato che ci vogliono fino a 30 minuti fino a quando le sostanze sono assorbite attraverso la membrana del guscio d'uovo ed entrano in stretto contatto con la membrana corio-allantoidea, non è possibile quantificare una risposta rapida dell'embrione al composto applicata. Inoltre, alcuni composti possono essere tossiche in concentrazione applicata, che spesso si traduce in lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea. Così, la citotossicità test basati su incubazione a lungo termine dei composti per circa 24 ore appare ragionevole. Infine, abbiamo trovato che il sistema di buffer utilizzato per l'applicazione dei composti ha un effetto significativo sulle prestazioni del dosaggio. 12 attualmente, HBSS buffer viene utilizzato perché si traduce in più leggero effetto sui livelli di glucosio nel sangue dell'embrione.
Per le applicazioni future, possono essere testati sistemi buffer aggiuntivo come alternativa a HBSS. Inoltre, l'influenza di estratti di erbe su sangue ulteriori parametri come colesterolo, trigliceridi o lipoproteine potrebbe essere una domanda interessante.
Il nostro nuovo sistema di in-ovo è un importante e promettente strumento per testare le sostanze con caratteristiche insulino-mimetici in un organismo vivente senza la necessità di un esperimento sugli animali. Pertanto, colma il divario tra gli approcci in vitro e in vivo . Rispetto alle esistenti in ovo modello sistemi17 non c'è nessun bisogno di indurre il diabete dal trattamento di streptozotocin (STZ), come usiamo gli embrioni al giorno 10 o 11 di incubazione. In questa fase, non ha iniziato la produzione di insulina, ma gli embrioni sono già insulina sensibile. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico potrebbe essere richiesto se usate17embrioni all'età di 14-17 giorni. Inoltre, rispetto a strategie alternative18, l'applicazione di composto come descritto qui è meno nocivo e laborioso, aumentando i tassi di attraverso-metta sperimentali.
Presi insieme, questo in-ovo approccio è un sistema interessante se un effetto sangue-diminuzione della sostanza insulino-mimetici deve essere testato in un organismo vivente.

Diabete mellito è una malattia metabolica caratterizzata da iperglicemia ed è causato da difetti nella secrezione dell'insulina o insulina azione1. Novanta per cento di tutti i casi di diabete sono categoria diabete mellito di tipo 2 (T2DM), dove gli individui dimostrano l'insulino-resistenza e per lo più insulina carenza2. Parecchi fattori sono conosciuti per aumentare l'incidenza globale di T2DM, compreso i cambiamenti nello stile di vita, specialmente quelle relative alla sovranutrizione, l'invecchiamento e l'inattività fisica. Circa 400 milioni di persone hanno il diabete mellito in tutto il mondo secondo l'International Diabetes Federation (IDF). Questo numero è destinato a raggiungere 600 milioni entro i prossimi 20 anni3.
Complicazioni diabetiche causate da iperglicemia ed insulino-resistenza, quali ipertensione, dislipidemia, intolleranza al glucosio, malattia coronarica e malattia vascolare cerebrale, portano ad una significativamente ridotta aspettativa di vita e qualità4. Gli individui commoventi richiedono abbassamento farmacoterapia; Tuttavia, l'utilizzo di farmaci, come la metformina5 spesso è associato con drammatici effetti collaterali6,7,8. Pertanto, sono necessari ulteriori approcci antidiabetici che sono sicura, ampiamente disponibile ed economica.
Nutraceuticals, estratti, piante e diversi composti a base di erbe sono state attribuite alla proprietà insulino-mimetici di funzione modulando varie funzioni cellulari. Una caratteristica importante è la stimolazione della traslocazione del trasportatore del glucosio (GLUT4) 4 alla membrana plasmatica da scompartimenti di immagazzinaggio intracellulare, risultante in un maggiore assorbimento del glucosio in muscolo e tessuto adiposo in assenza di insulina, noto come Proprietà insulino-mimetici9. In precedenza, abbiamo implementato un approccio di base di microscopia di fluorescenza per quantificare il processo di traslocazione di GLUT410. Analisi di numerosi estratti vegetali da un Estratto di libreria11 usando questa analisi ha portato alla identificazione di candidati promettenti. Tuttavia, ulteriori prove negli organismi viventi sono necessari. L'approccio descritto in dettaglio in questa carta, un modello di embrione di pulcino modificate, ha dimostrato di essere un modello promettente per l'identificazione di sostanze con proprietà insulino-mimetici. Esso rappresenta uno strumento attraente l'ampio divario fra gli studi in vitro e in vivo di riempimento e offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi esistenti quali costi accettabili, le procedure di movimentazione semplice e adeguata velocità di trasferimento. Inoltre, l'autorizzazione da un comitato etico non è necessaria.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:279px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:140px;">Biochrom</td>
			<td style="width:123px;">L1825</td>
			<td style="width:80px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30268.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NovoRapid</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>8-0905-82-304-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hens eggs (Lohmann classic brown chicken)</td>
			<td>Local Breeder</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check performa</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6454011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Accu-check Inform II Teststreifen</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>5942861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator&#160; HEKA- Turbo 288</td>
			<td>HEKA Brutger&#228;te</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe Omnican F 1 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>09161502S&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extracts</td>
			<td>PEKISH extract library</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lamp Tempo Nr. 119</td>
			<td>ORBAN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in ovo model for testing insulin-mimetic compounds

I livelli elevati della glicemia nel diabete mellito di tipo 2 (T2DM), una malattia metabolica complessa e multifattoriale, sono causati da errori della β-cellula e resistenza di insulina. Varie strategie, tra cui l'iniezione di insulina o l'utilizzo di farmaci insulino-sensibilizzanti, sono state perseguite per trattare T2DM o almeno ridurre i sintomi. Inoltre, l'applicazione di composti a base di erbe ha attirato l'attenzione aumentante. Pertanto, è necessario trovare sistemi di test efficiente di identificare e caratterizzare composti insulino-mimetici. Qui abbiamo sviluppato un modello di embrione di pulcino modificate, che consente il test di composti sintetici ed estratti di erbe con proprietà insulino-mimetici. Utilizzando un fluorescenza basati su microscopia schermo primario, che quantifica la traslocazione del trasportatore del glucosio (Glut4) 4 alla membrana plasmatica, siamo stati in grado di identificare i composti, principalmente estratti di erbe, che conducono ad un aumento di glucosio intracellulare concentrazioni nei adipocytes. Tuttavia, l'efficacia di queste sostanze richiede ulteriore verifica in un organismo vivente. Così, abbiamo usato un approccio in-ovo per identificare le proprietà di riduzione del glucosio nel sangue. L'approvazione di un comitato etico non è necessaria poiché l'utilizzo di embrioni di pollo durante i primi due terzi dello sviluppo embrionale non è considerato un esperimento sugli animali. Qui, l'applicazione di questo modello è descritto in dettaglio.

Descrizione dell'approccio Gluc-HET:
Dopo incubazione con le sostanze di interesse, le uova fecondate sono aperti e preparate per la raccolta del sangue da rimozione del guscio d'uovo (Figura 2). Ulteriore preparazione include equilibrazione e rimozione della membrana guscio d'uovo per ottenere l'accesso alla membrana corio-allantoidea. Questa membrana è quindi tagliata attentamente per fornire l'accesso a un vaso sanguigno adatto per la raccolta del sangue. Preferibilmente, la grande nave proveniente dall'addome dell'embrione è collocata su una striscia di plastica pH. Per evitare la diluizione del sangue durante la raccolta, la nave e la pH-striscia è asciugati con carta da filtro. Il vaso sanguigno viene poi tagliato e colatura sulla striscia di pH del sangue è raccolto per l'analisi utilizzando una pipetta.
Effetti di estratti di erbe selezionati sui livelli di glucosio nel sangue:
Con un recente costituzione GLUT4-traslocazione quantificazione schermo basato su primaria, siamo in grado di identificare le sostanze con un caratteristico insulino-mimetici10. Lo screening di centinaia di estratti di erbe solubile in acqua ha portato alla identificazione di parecchi colpi. Questi estratti sono stati testati nel nostro modello di ovo in. Gli estratti preparati da Combretum indicum (creeper Rangoon) e un estratto non forniti (chiamato Estratto 0845) sono stati utilizzati per questi esperimenti. Abbiamo sciolto gli estratti nel buffer di HBSS a 300 mg/L, una concentrazione che si è rivelato per essere appropriato in precedenti studi12,13. Le sostanze sono state applicate agli embrioni incubati per 11 giorni. Come indicato nella Figura 3, l'estratto dalla pianta rampicante Rangoon non ha provocato un significativo sangue glucosio riduzione in ovo. Tuttavia, la concentrazione di glucosio nel sangue è stato ridotto con successo con Estratto 0845, con una diminuzione secondaria dopo 60 min, che è paragonabile all'effetto osservato usando un'analogico di insulina disponibile in commercio. Un effetto significativo è stato osservato quando il tempo di incubazione delle uova è stato prolungato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Figura 1: influenza di composti tossici sulla vitalità dell'embrione. Uova sono state incubate per 11 giorni (A e C) o trattate con un Estratto di erbe tossico il giorno 10 per altre 24 ore (B e D). Applicazione dell'estratto hanno portato a gravi lesioni dei vasi sanguigni della membrana corio-allantoidea (D) e l'embrione (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Figura 2: Descrizione del modello in-ovo . Da sinistra a destra: apertura e la rimozione del guscio d'uovo (1 - 2); equilibratura e la rimozione della membrana guscio d'uovo con membrana chorioallantoic esposti (3); recipiente di preparato su un nastro di pH (4); la raccolta di sangue e misurazione della concentrazione di glucosio utilizzando un misuratore di glucosio (5). Adattato da Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Figura 3: effetto di estratti di erbe sui livelli di glucosio nel sangue rispetto alle uova non trattate o trattati con insulina. Le uova sono state incubate per 11 giorni e trattate con le sostanze indicate (commercialmente disponibile insulina analogico: 3.3 U/mL; estratti: 300 mg/L) dissolto nel buffer di HBSS (300 µ l di volume) per fino a 3 h. sangue i livelli del glucosio sono stati determinati utilizzando un misuratore di glucosio del sangue. Risultati sono mostrati senza l'effetto del buffer. Barre di errore sono basati sull'errore standard della media. * P < 0.05 e * * * P < 0,0001, significativa diminuzione rispetto alle uova HBSS-trattati dello stesso tempo di incubazione. Adattato da Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un'adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l'identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.

Un modello In Ovo per testare composti insulino-mimetici

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

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An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

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9.6K Views.  University of Applied Sciences Upper Austria. In questo studio, descriviamo un sistema in-ovo come un promettente strumento per testare composti insulino-mimetici in un organismo vivente. I principali vantaggi includono un'adeguata velocità di trasferimento e costi accettabili, che consentano l'identificazione di sostanze fitochimiche con proprietà insulino-mimetici.

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Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

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Neuroscienze

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Design and Assembly of an Ultra-light Motorized Microdrive for Chronic Neural Recordings in Small Animals

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of neural circuits underlying a variety of natural behaviors, including navigation1 , decision making 2,3, and the generation of complex motor sequences4,5,6. Advances in precision machining has allowed for the fabrication of light-weight devices suitable for chronic recordings in small animals, such as mice and songbirds. The ability to adjust the electrode position with small remotely controlled motors has further increased the recording yield in various behavioral contexts by reducing animal handling.6,7
 Here we describe a protocol to build an ultra-light motorized microdrive for long-term chronic recordings in small animals. Our design evolved from an earlier published version7, and has been adapted for ease-of use and cost-effectiveness to be more practical and accessible to a wide array of researchers. This proven design 8,9,10,11 allows for fine, remote positioning of electrodes over a range of ~ 5 mm and weighs less than 750 mg when fully assembled. We present the complete protocol for how to build and assemble these drives, including 3D CAD drawings for all custom microdrive components.

The design, fabrication and assembly of an ultra-light motorized microdrive is described. The device provides a cost-effective and easy-to-use solution for chronic recordings of single units in small behaving animals.

Progettazione e assemblaggio di un ultraleggero motorizzato per Microdrive croniche Recordings neurali in animali di piccola taglia

The ability to chronically record from populations of neurons in freely behaving animals has proven an invaluable tool for dissecting the function of ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response is a vision-based, reflexive behavior that has been observed in all vertebrates tested. Tadpole eyes are small so the tail flip response was used as alternative measure, which requires a trained technician to record the subtle response. We developed an alternative behavior assay based on the fact that tadpoles prefer to swim on the white side of a tank when placed in a tank with both black and white sides. The assay presented here is an inexpensive, simple alternative that creates a response that is easily measured. The setup consists of a tripod, webcam and nested testing tanks, readily available in most Xenopus laboratories. This article includes a movie showing the behavior of tadpoles, before and after severing the optic nerve. In order to test the function of one eye, we also include representative results of a tadpole in which each eye underwent retinal axotomy on consecutive days. Future studies could develop an automated version of this assay for testing the vision of many tadpoles at once.

A Simple Behavioral Assay for Testing Visual Function in Xenopus laevis

Xenopus laevis tadpoles prefer swimming on the white side of a black/white tank. This behavior is guided by their vision. Based on this behavior, we present a simple assay to test the visual function of tadpoles.

Un test comportamentale semplice for Testing Funzione visiva in<em&gt; Xenopus laevis</em

Measurement of the visual function in the tadpoles of the frog, Xenopus laevis, allows screening for blindness in live animals. The optokinetic response ...

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell leukodystrophy (GLD) is unclear. This gap in knowledge has been hindered by the lack of an appropriate in vitro model for study. Herein, we describe a primary murine glial culture system in which treatment with psychosine results in multinucleation of microglia resembling the characteristic globoid cells found in GLD. Using this novel system, we defined the conditions and modes of analysis for study of globoid cells. The potential use of this model system was validated in our previous study, which identified a potential role for matrix metalloproteinase (MMP)-3 in GLD. This novel in vitro system may be a useful model in which to study the formation and function, but also the potential therapeutic manipulation, of these unique cells.

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

Simultaneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Test funzionale di due retine per<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Elettroretinogramma

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modello preclinico per valutare il recupero del cervello dopo l'ictus acuto nei ratti

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...