L'obiettivo di questa procedura è determinare la produzione epatica di glucosio in una sindrome dell'ovaio policistico o modello murino PCOS. Il metabolismo disregolato del glucosio è una manifestazione importante della PCOS ed è la chiave per la sua patogenesi. Pertanto, gli studi che coinvolgono la valutazione del metabolismo del glucosio nella PCOS sono della massima importanza.
In questo studio, discutiamo le istruzioni passo-passo per la quantificazione del tasso di produzione di glucosio epatico in un modello murino PCOS misurando l'arricchimento M più due di sei sei glucosio deuterato, un tracciante di glucosio isotopico stabile, tramite gascromatografia, spettrometria di massa o GCMS. Questa procedura prevede la creazione di una soluzione stabile di tracciante isotopico del glucosio, l'uso del posizionamento del catetere della vena della coda e l'infusione del tracciante del glucosio sia a digiuno che ricchi di glucosio nello stesso topo in tandem. Un giorno prima della procedura, preparare il tracciante di glucosio isotopico stabile in soluzione salina normale.
Per questo esperimento, la produzione di glucosio durante il digiuno in condizioni ricche di glucosio è stata misurata in modo che l'isotopo del glucosio sia stato preparato in due diversi preparati. Il tracciante è stato preparato in condizioni sterili sciogliendo sei sei semideterminati sterili e privi di pirogeni e soluzione sterile di cloruro di sodio allo 0,9% con o senza glucosio. Il primo infuso è stato preparato con solo il tracciante.
Il secondo infuso conteneva sia il tracciante che il glucosio non isotopico. Una volta preparate le soluzioni, sono state filtrate sterili con il filtro da 0,22 micron e conservate a quattro gradi Celsius. Le soluzioni sono state preparate in modo tale che la dose finale di infusione fosse vicina a un milligrammo per chilogrammo e minuto e due milligrammi per chilogrammo e minuto rispettivamente.
Per la misurazione del tasso di comparsa del glucosio durante la condizione basale in condizioni ricche di glucosio, è stata utilizzata un'infusione media a velocità costante innescata di sei sei glucosio deuterato a 1,08 milligrammi per chilogrammo e minuto e 1,9 milligrammi per chilogrammo al minuto rispettivamente. Al fine di imitare lo stato di alimentazione, abbiamo impiegato una velocità media di infusione di D-glucosio di 18,8 milligrammi per chilogrammo e minuto durante la condizione ricca di glucosio. Rimuovi i topi dalle loro gabbie domestiche e mettili nelle loro gabbie di digiuno tre ore prima dell'inizio dell'esperimento.
Per questo esperimento, abbiamo usato topi femmina di quattro mesi del ceppo C57BL6J. Assemblare l'attrezzatura di ingabbiamento raggruppando i topi in un determinato numero di topi per pompa di insulina. Posiziona le partizioni sopra una base piatta e stabile per creare stalli individuali per i topi.
Le gabbie sono chiare e realizzate in plexiglass. C'è una base piatta e stabile su cui si trovano le partizioni. La porta della gabbia scorre per chiudersi e ha una tacca nella parte inferiore per consentire alla coda di passare.
Assemblare le siringhe contenenti un millilitro di infuso basale, quindi collegarsi al tubo della pompa di infusione utilizzando il tubo di polietilene. Preparare la pompa di infusione impostando la velocità su 150 microlitri all'ora, che è la velocità basale. Riscaldare un bagno d'acqua a 48 gradi Celsius.
Preparare la stazione di inserimento del catetere adiacente al bagno d'acqua contenente gli aghi da mezzo pollice calibro 30, tubi silastici e nastro di trasporto trasparente da un pollice. Selezionare un mouse e posizionarlo in un supporto sicuro con accesso alla coda. Posizionare un pezzo di nastro adesivo sopra la porzione prossimale della coda per consentire lo spazio per l'inserimento del catetere in modo più distale.
Portare il mouse a bagnomaria e inserire la coda nel bagno d'acqua per circa 30-45 secondi. Questo aiuta a dilatare la vascolarizzazione della coda per il posizionamento del catetere. L'inserimento del catetere deve essere effettuato in condizioni sterili.
Una volta riscaldata la coda, pulisci la coda e posiziona un piccolo morsetto di alligatore senza denti di rame come laccio emostatico all'estremità prossimale della coda. Visualizza la vena laterale della coda sotto una lente d'ingrandimento. Quindi, inserire con attenzione il catetere nella vena della coda e lavare delicatamente la soluzione per garantire la pervietà del catetere.
Avvolgere un pezzo di nastro di trasporto attorno al sito di inserimento per fissare il catetere e rimuovere il piccolo laccio emostatico dalla coda. Posiziona il topo nella sua gabbia individuale e chiudi la porta scorrevole, assicurandoti che la coda sporga attraverso la tacca e rimanga all'esterno della gabbia. Posizionare un ulteriore pezzo di nastro adesivo su tutto il catetere e la coda per fissarlo alla piastra di base della gabbia.
Scollegare il filo dal catetere della vena di coda e posizionare il piccolo morsetto sul tubo silastico del catetere per evitare il riflusso mentre si collega la linea di infusione dalla pompa. Una volta fissato saldamente, rimuovere il morsetto e lavare la soluzione di adescamento che consiste nell'infuso. Assicurarsi che la soluzione sia limpida nel tubo e non macchiata di sangue.
Una volta che le linee di infusione sono notate per funzionare correttamente, rimuovere il coperchio dal mouse. Posiziona la biancheria da letto standard attorno al mouse. Iniziare l'infusione con l'infuso contenente il tracciante ed eseguirlo per tre ore ininterrottamente.
Per tutta la durata dell'infusione, continuare a controllare il benessere dei topi, così come le linee di infusione. Assicurarsi che il tubo di infusione sia fissato correttamente e che non vi siano perdite dai punti di connessione della linea. Dopo che la prima infusione è stata completata, interrompere l'infusione e posizionare un morsetto sul tubo del catetere per evitare il riflusso.
Rimosso delicatamente i topi dai loro recinti senza disturbare il catetere per raccogliere il sangue. Per questo esperimento, i topi sono stati sottoposti a puntura della vena della guancia usando una lancetta di quattro millimetri. Raccogliere circa 75 microlitri di sangue nel flaconcino desiderato.
Per deproteinizzare i campioni in preparazione per la spettrometria di massa, aggiungere circa 15 microlitri di sangue a 500 microlitri di acetone. Il sangue rimanente può essere utilizzato per controllare il livello di glucosio nel sangue tramite glucometro e / o una centrifuga per separare il plasma per futuri test ormonali. Rimuovere l'infuso dalle pompe della siringa scollegando il tubo dalle siringhe e sostituirlo con il secondo infusato contenente tracciante insieme al glucosio.
Ripetere le fasi di infusione precedenti utilizzando l'infusione isotopica di glucosio ricca di glucosio. Per raggiungere lo stato stazionario, eseguire un bolo del secondo infuso a 600 microlitri all'ora per 15 minuti. Nota l'ora di inizio per ogni gruppo di gabbie.
Ridurre la velocità di infusione a 150 microlitri all'ora per completare le tre ore di tempo totale di infusione. Ripetere il prelievo di sangue come descritto in precedenza. Scollegare le infusioni, applicare pressione nei siti del catetere fino a quando l'emorragia si ferma e riportare i topi alle loro gabbie domestiche.
Successivamente, i campioni vengono inviati per GCMS. Calcolare l'arricchimento isotopico dell'isotopo del glucosio sotto il picco di glucosio mediante GCCMS utilizzando il derivato del pentaacetato. In breve, questo metodo prevede la preparazione del derivato pentaacetato del glucosio, seguita da analisi del campione utilizzando GCMS nella modalità di ionizzazione chimica positiva.
Il monitoraggio selettivo degli ioni del rapporto massa-carica, da 171 a 169, viene eseguito per determinare l'arricchimento M più due dell'isotopo del glucosio. Tutte le misurazioni cinetiche vengono eseguite assumendo condizioni di stato stazionario. Calcola il tasso di comparsa totale del glucosio plasmatico dall'M più due arricchimenti dell'isotopo del glucosio e del plasma utilizzando equazioni di diluizione isotopica stabilite.
In condizioni di stato stazionario, si presume che il tasso di comparsa del glucosio sia uguale al tasso di scomparsa del glucosio. Il tasso di produzione di glucosio endogeno è uguale al tasso di glucosio plasmatico totale meno il glucosio esogeno. La tabella uno include i risultati rappresentativi dello studio.
Tutte le unità sono espresse in milligrammo per chilogrammo e minuto. Utilizzando equazioni di diluizione isotopica precedentemente descritte, è stata calcolata la velocità totale del glucosio plasmatico. Nel gruppo di controllo, il tasso medio di glucosio di comparsa era 19,98 nello stato di digiuno.
In condizioni ricche di glucosio, il tasso di comparsa del glucosio era 25,8. Il tasso di produzione di glucosio era 19,08 nello stato di digiuno e 8,56 nello stato ricco di glucosio. Il metabolismo anormale del glucosio e l'omeostasi sono comuni nella PCOS.
Nei disturbi del metabolismo anormale del glucosio, la regolazione della soppressione della produzione di glucosio è compromessa portando all'iperglicemia. In questo studio, descriviamo un modo semplice per misurare il tasso di produzione di glucosio epatico in più topi contemporaneamente. I componenti critici di questo esperimento sono l'inserimento del catetere e la definizione delle misurazioni esatte dell'isotopo del glucosio e del glucosio naturale al fine di eseguire adeguatamente GCMS.
I vantaggi dello studio sono la realizzazione dell'infusione in modo minimamente invasivo a causa dell'inserimento del catetere della vena della coda, nonché l'uso di un tracciante del glucosio stabile e facilmente raggiungibile. Ci sono alcune limitazioni allo studio, tra cui la richiesta tecnica della procedura e la necessità di possibili competenze aggiuntive. Nel complesso, descriviamo un modo semplice e accurato per misurare il tasso di produzione totale di glucosio epatico in un modello murino PCOS.
Questa tecnica potrebbe servire come base per più studi che coinvolgono il metabolismo del glucosio di modelli murini.
