Per iniziare, aggiungere 50 microlitri di microsfere CD90.2 anti-topo alle cellule polmonari isolate. Dopo aver agitato la miscela, incubarla per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, posizionare una colonna di separazione cellulare paramagnetica su un magnete di separazione cellulare a una o quattro posizioni.
Posizionare un tubo conico aperto da 15 millilitri sotto ogni colonna per catturare il flusso. Adescare la colonna con tre millilitri di tampone selezionatore a freddo, consentendo alla colonna di drenare per gravità nel tubo conico sottostante. Dopo che le cellule sono state incubate con le microsfere per 10 minuti, aggiungere un tampone selezionatore a freddo fino a un volume di un millilitro e trasferire la miscela attraverso un colino cellulare da 100 micrometri posto sopra la colonna.
Raccogliere il flusso della colonna in un tubo conico fresco da 15 millilitri posto sotto la colonna. Una volta che la sospensione cellulare è completamente scaricata attraverso la colonna, aggiungere altri tre millilitri di tampone di selezione a freddo alla provetta originale e applicarlo alla colonna attraverso la rete prima di rimuovere il filtro. Quando il campione è completamente defluito nella colonna e non esce più alcun flusso, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo conico fresco da 15 millilitri.
Aggiungere cinque millilitri di tampone per selezionatore a freddo alla colonna. Per eluire le cellule legate, spingere lo stantuffo della colonna verso il basso con un movimento continuo, forzando il tampone fuori dal fondo in un nuovo tubo. Centrifugare i campioni eluiti a 400 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Aspirare con cura il surnatante, lasciando circa 100 microlitri di surnatante e il pellet cellulare. In media, il processo di arricchimento recupera oltre il 99% di tutte le cellule T CD90.2 positive dai polmoni con una purezza superiore al 90%.
