Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), il Dipartimento della Difesa DOD sovvenzione PC 040.972 (MO) e l&#39;Istituto Nazionale della Sanità concede RO1 CA108835 , RO1 Ai44129 (JPS)

1 Generazione di HLA-A2-Ig Based KaAPC <ol><li> Preparare tampone borato sterile. Fare una soluzione 0,1 M di acido borico in acqua e regolare il pH a 7,0. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare sterile tampone di lavaggio tallone. Utilizzare tampone fosfato salino (PBS) senza magnesio e calcio. Aggiungi siero AB umano per concentrazione finale del 3%. Aggiungi etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 2 mM di concentrazione finale. Aggiungi sodio azide (NaN 3) per la concentrazione finale 0,01%. Filtro sterile (0,22 micron) tampone e conservare a 4 ° C. </li><li> Trasferire 250 ml di perline epossidici (circa 100 x 10 6 perline) a magazzino in una sterile, con tappo a vite fiala di vetro. </li><li> Aggiungere 250 ml di tampone borato. </li><li> Mettere fiala di vetro su un magnete e lasciate perline aderire per 2 min; tampone aspirare e rimuovere flaconcino di vetro da magnete. </li><li> Lavare perline una volta con 1 ml di tampone borato. </li><li> Risospendere le sfere in 550 ml di 0.018 mcg/ Ml HLA-A2-Ig e 3.64 mg / ml di anti-umano CD95 monoclonale (clone CH11) e mescolare delicatamente agitando. (Si prega di consultare la sezione di discussione per ulteriori informazioni.) </li><li> Incubare fiala di vetro su una estremità rotatore sopra fine, a 4 ° C per 24 ore. </li><li> Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. </li><li> Posizionare flaconcino di vetro su un magnete per 2 minuti e aspirare la &quot;soluzione di carico KaAPC&quot;; rimuovere fiala di vetro da magnete, aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio tallone e risospendere accuratamente agitando. </li><li> Ripetere il punto 1.10 due volte. </li><li> Incubare fiala di vetro su un rotore a 4 ° C per 24 ore in 1 ml di tampone di lavaggio tallone. A questo punto, tutti i siti di legame con le proteine ​​residue sarà bloccato da siero AB umano contenute nel tampone di lavaggio tallone. </li><li> Spin down perline a 300 xg per 2 minuti. </li><li> Luogo ampolla di vetro su una calamita per 2 min e tampone di aspirare tallone di lavaggio; rimuovere fiala di vetro da magnete e sostituire soluzione di 1 ml di PBS. </li></ol> 2 Controllo di qualità, Peptide Loading, Wincenerimento, conservazione e la stabilità di KaAPC <ol><li> Trasferire 1,5 x 10 5 KaAPC in un tubo FACS e lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio. </li><li> Risospendere le sfere in 100 ml FACS tampone di lavaggio e aggiungere 1 ml di anti-topo IgG1 PE (per il rilevamento della parte Fc di HLA-A2-Ig) e 1 ml di anti-topo IgM FITC (clone R6-60.2, per il rilevamento del CD95 mAb anti-umano). </li><li> Incubare per 15 min a 4 ° C, lavare con 1 ml FACS tampone di lavaggio, e risospendere in 250 microlitri FACS tampone di lavaggio e leggere macchie mediante citometria a flusso. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 QC macchia di un lotto KaAPC realizzata come indicato nella sezione del protocollo. Colorazione è stata eseguita come descritto nella sezione 2 del protocollo HLA-A2-Ig è stato rilevato utilizzando un anti-topo-IgG1 PE mAb, mentre anti-umano-CD95 (anti-Fas) è stata rilevata con un anti-mouse FITC IgM monoclonale (vedi protocollo section 2.2) (linea blu). Grafici nero pieno rappresentano perle vuoti colorati con anti-topo-IgG1 PE mAb o anti-topo-IgM FITC mAb, rispettivamente. I numeri in alto a destra indicano l&#39;intensità di fluorescenza media (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="4"><li> Per peptide trasferimento di carico 20 x 10 6 KaAPC in un nuovo flacone di vetro sterile, collocare su una calamita per 2 minuti, aspirare PBS e risospendere le perline in 500 microlitri PBS fresco con 5 mcg peptide (Tenete a mente, solo peptidi HLA-A2 ristretti volontà impegnare sul dimero!). </li><li> Conservare caricato KaAPC a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso, per almeno 3 giorni per consentire sufficiente peptide carico sul dimero HLA-A2-Ig. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, lavare il peptide caricata KaAPC come indicato in 1.14; ripetere questo passaggio almeno 6x. NOTA: Questo è un passo fondamentale per assicurare che il peptide libero ha to essere completamente rimosso per evitare falsi risultati positivi di sterminio; residua peptide libero ha dimostrato di indurre apoptosi in antigene-specifiche colture di cellule T 9. Per escludere un effetto peptide solubile, eseguire campioni di controllo surnatante di peptide caricato e lavato KaAPC (vedi 3.8). </li><li> Conte perline utilizzando emocitometro e l&#39;etichetta con la data, il nome del peptide e la concentrazione. NOTA: Loaded KaAPC resta funzionale a 4 ° C per almeno un mese. Dopo un mese, ri-caricamento con lo stesso peptide permette KaAPC per essere utilizzato per un massimo di un anno. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Assay Uccidere <ol><li> Preparare co-coltura. Preparare mezzo completo RPMI supplementato con 3% T fattore di crescita delle cellule (made in laboratorio 6) e il 3% dei donatori di plasma autologo. Se il donatore di plasma autologo non è disponibile, utilizzare siero umano AB inattivato al calore. </li><li> Preparare AnnexinV vincolante preparazione del buffer. Sciogliere 8,12 g di cloruro di sodio (NaCl) e 0,12 g calccloruro ium (CaCl 2) in 990 ml di DDH 2 O.Add 10 ml di tampone di 1M HEPES. </li><li> Generazione di cellule T antigene-specifiche umani. (Per un protocollo dettagliato consultare una pubblicazione precedente 7 artificiali utilizzando cellule presentanti l&#39;antigene (AAPC)). Assicurarsi che la specificità peptide è almeno&gt; 75% come determinato dal tetramero colorazione. </li><li> Per ogni campione incubare 2 x 10 5 cellule T antigene-specifiche / pozzetto (in una piastra inferiore 96 ben rotondo) in 200 ml di mezzo di co-coltura in un rapporto 1: 1 con KaAPC per 48 ore in un incubatore umidificato a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Campioni di raccolta e trasferire in una provetta FACS; lavare con 1 ml AnnexinV binding buffer, centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 100 ml di AnnexinV binding buffer </li><li> Campioni macchia con 1 ml AnnexinV FITC e 5 microlitri 7-AAD per 10-15 min a RT, lavare con 1 ml di AnnexinV binding buffer; spin down a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante und risospendere in 250 microlitri AnnexinV binding buffer </li><li> Leggi i campioni immediatamente al citofluorimetro. </li><li> Preparare i seguenti campioni per determinare uccisione antigene-specifica da KaAPC: solo le cellule T; Cellule T + solubili anti-CD95; Cellule T + scaricati KaAPC; Cellule T + peptide non-cognate caricato KaAPC; Cellule T + peptide cognate caricato KaAPC; Cellule T + surnatante del peptide cognate caricato KaAPC. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . Figura 2 KaAPC test uccidendo Peptide caricato KaAPC o sfere di controllo (solo HLA-A2-Ig perline) sono state coltivate per 48 ore in un rapporto 1: 1 con le cellule CMVpp65 specifici T (~ 80%), raccolte e successivamente tinto con AnnexinV e ioduro di propidio (PI) per determinare l&#39;apoptosi mediante citometria di flusso (vedi sezione protocollo 3,3-3,7). &quot;parente&quot; si riferisce a microsfere caricate con CMVpp65 e &quot;non-cognate&quot; di essereAnnunci carichi di Mart-1 peptide. I numeri indicano la percentuale di cellule T vitali nel quadrante in basso a sinistra di ogni trama. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol start="9"><li> Per eseguire Intersecato-esperimenti, generare cellule T antigene-specifiche delle due specificità diverse. </li><li> Ulteriori valutare le capacità di deplezione-antigene-specifiche di KaAPC con una analisi simultanea di eliminazione antigene-specifica delle cellule T nella popolazione di cellule T eterogenea. (Per un protocollo dettagliato si veda Schütz et al. 10). </li></ol>

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	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS e MF hanno nulla da rivelare. Nell&#39;ambito di un accordo di licenza tra NexImmune e l&#39;Università Johns Hopkins, Drs. Schneck e Oelke hanno diritto alle azioni della regalità ricevute dall&#39;Università sulle vendite di prodotti AAPC descritti in questo articolo. Inoltre possiedono NexImmune magazzino, che è soggetta a determinate restrizioni nel quadro della politica University. Dr. Schneck è un membro della società &quot;s Consiglio di Amministrazione e Comitato di Consulenza Scientifica. I termini di questo accordo sono gestite dalla Johns Hopkins University in conformità con il suo conflitto di interessi politiche.

La fase più critica del protocollo è quello di garantire il corretto rapporto di segnale 1 (peptide MHC) e il segnale 2 (anti-Fas mAb). Abbiamo effettuato esperimenti di titolazione intensivi per definire il rapporto ideale per il segnale 1 e 2; divenne evidente che minime variazioni dovute a differenze nel dimero HLA-A2 Ig o concentrazioni di anti-Fas mAb possono interferire con la funzionalità del KaAPC. Pertanto, la concentrazione di entrambi i segnali deve essere sempre verificata e qualità di entrambe le proteine ​​devono essere frequentemente testato anche se è stato ordinato da una fonte commerciale. Inoltre, le concentrazioni devono sempre essere determinati dallo stesso dosaggio come diversi saggi di rilevamento potrebbero risultare in diverse concentrazioni. Funzionalità del HLA-A2-Ig può essere compromessa a causa di ripiegamento incompleta e / o inefficiente peptide carico. Inoltre le molecole dimero possono aggregare a diversi gradi, che possono influire sulla attività funzionale della proteina. Pertanto, l&#39;actuAl quantità di dimero necessaria per la generazione di un KaAPC funzionale e specifiche possono variare. Inoltre, abbiamo trovato che la gamma ideale per la morte indurre segnale anti-Fas mAb on KaAPC è estremamente stretto. Nelle nostre mani importi superiori 3.64 mcg / ml portare a non specifico uccisione di cellule T positive Fas mentre importi inferiori a 3,64 mg / ml hanno determinato una ridotta attività omicidio-dosi a seconda. Mentre queste condizioni sembrano piuttosto stretto, attenzione a questi dettagli comporterà la generazione di un KaAPC funzionale e specifico. Mentre l&#39;attuale fenotipo KaAPC è funzionale per la deplezione delle cellule T attivate antigene-specifiche, esperimenti iniziali di targeting di cellule T antigene-specifiche naïve o di riposo dimostrato alcuna significativa induzione di apoptosi antigene-specifica come queste popolazioni hanno ridotto l&#39;espressione Fas. Pertanto, si potrebbe prevedere l&#39;aggiunta di un segnale co-stimolatorio sulla KaAPC per indurre la up-regolazione di Fas su cellule T quiescenti per farli girarein un obiettivo per il KaAPC. Mentre questo è fattibile tutti e tre i segnali dovranno essere accuratamente titolata a garantire un funzionale KaAPC fenotipo. Regolazione della piattaforma tallone per una matrice biocompatibile e biodegradabile rafforzerà KaAPC di applicabilità vivo. Recentemente, Shen et al. Hanno riportato il successo nell&#39;uso vivo di KaAPC utilizzando perline 5 micron di lattice coniugate ad anti-Fas (clone Jo2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Siamo stati in grado di dimostrare che il concetto generale di cellule presentanti l&#39;antigene artificiali (AAPC) può essere trasferito con successo da micron dimensionata per particelle di dimensioni 12 nm e che la funzionalità è influenzata dalla geometria della particella 13. Quindi, variando la dimensione e / o forma del futuro KaAPC disegni si potrebbe essere in grado di influire sulla funzionalità in vivo e bio-distribuzione, che potrebbe essere fondamentale per il successo del trattamento di specifiche malattie autoimmuni organo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC superare le gravi carenze delle strategie di deplezione delle cellule basato come un facile da usare &quot;off the shelf&quot;, il tempo e l&#39;approccio efficiente costo che è indipendente dalla condizione di donatore e pre-trattamento. KaAPC non sono obiettivi di autoregolamentazione o di uccisione di segnalazione paracrina e non sensibile alle funzioni effettrici citolitiche di CTL. KaAPC richiederà l&#39;identificazione dell&#39;antigene malattia in questione e si basano sul loro tipo HLA specifico. Mentre attualmente numerosi antigeni HLA-A2 ristretti adatti per il diabete di tipo 1, GvHD e multipli di sclerosi sono stati identificati 2, lo sviluppo di ulteriori HLA di classe I dimero molecole così come la continua identificazione di nuovi antigeni rilevanti autoimmuni aumenterà ulteriormente e ampliare l&#39;applicabilità di KaAPC. Inoltre si potrebbe pensare di utilizzare KaAPC diretta a diversi epitopi di indirizzare antigeni multipli contemporaneamente. In sintesi, KaAPC rappresentano una tecnologia di piattaforma flessibile per unaspecifica-tigen deplezione delle cellule T. La loro natura &quot;lego-like&quot; permette l&#39;inserimento di nuovi segnali, come i segnali co-stimolatori o inibitori aggiuntive come PD1 o TRAIL su varie matrici, che potrebbe ampliare e migliorare la loro successiva in vitro e in vivo applicabilità. Noi qui presentiamo il protocollo step-by-step per generare KaAPC, l&#39;approccio basato primo tallone per l&#39;eliminazione delle cellule T antigene-specifiche da miscele di cellule T con differenti specificità. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 KaAPC eliminare CTL in modo specifico per l&#39;antigene PKH26-etichettato attivato Fas + CTL effettori-memoria e PKH67-etichettato CMVpp65-specifici CTL dallo stesso donatore sono stati mescolati a un 1:. Rapporto 1 e co-coltura con CMVpp65 KaAPC per 48 h. Colture di controllo sono stati trattati con scarico KaAPC, o 1 mg / mldi solubili anti-Fas-monoclonale (clone CH11). Minima perdita di cellule vitali è stata determinata in colture non trattate miste CTL (T mix). Sono mostrati i dati FACS originali per ogni popolazione CTL del mix T. L&#39;analisi di apoptosi è stata eseguita come precedentemente pubblicato da gating separato su entrambi popolazioni di cellule T 10. I numeri raffigurati nei quadranti superiori di sinistra rappresenta% delle cellule totali. La figura illustra deriva da un esperimento rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Questa ricerca è stata originariamente pubblicata nel sangue. . Schütz, C. et al Killer cellule presentanti l&#39;antigene artificiale: una nuova strategia per eliminare le cellule T specifiche Sangue.. 2008; 111, 3546-52. Copyright della Società Americana di Ematologia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Negli ultimi due decenni sono stati compiuti molti progressi nella comprensione dei meccanismi patogenetici delle malattie autoimmuni. Tuttavia, i trattamenti più comuni si basano ancora su corticosteroidi e farmaci immunosoppressori, come analoghi delle purine, agenti alchilanti e inibitori della calcineurina 1. L&#39;uso di tali farmaci ha notevolmente migliorato la prognosi dei pazienti, ma il trattamento non fornire una cura della disfunzione immunologica sottostante. Inoltre, i pazienti diventano vulnerabili alle infezioni e allo sviluppo del cancro. Quindi l&#39;obiettivo finale per il trattamento delle cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto è quello di indirizzare specificamente unica malattia che causa le cellule T, mentre, allo stesso tempo, lasciando il sistema immunitario rimanente intatto e competente a combattere i disturbi immunologici. Utilizzando cellule presentanti l&#39;antigene (APC) come trattamento per sopprimere le risposte delle cellule T periferiche è stato descritto già nel1970 da diversi gruppi. Dal momento che sono stati sviluppati poi molti approcci basati su celle (rivisto in Schütz et al. 2). Strategie che usano-FasL esprimono killer-APC come cellule immunomodulanti hanno mostrato risultati promettenti che indicano potenziale terapeutico per il trattamento di autoimmunità, rigetto e le infezioni croniche. Tuttavia, ci sono delle limitazioni significative con le strategie che utilizzano FasL Killer-APC che hanno in ultima analisi, limitato la loro applicabilità clinica; (I) la generazione o l&#39;isolamento di APC è tempo, lavoro e dispendiosa (ii) pazienti affetti da citopenia causa immunosoppressione fornire quantità limitate e la qualità delle cellule (iii) il rivestimento o trasduzione di APC con apoptosi inducendo segnali quali risultati FasL a altamente fenotipi variabili e (iv) Killer-APC sono sensibili citotossica funzioni effettrici delle cellule T di conseguenza riducendo il loro potenziale terapeutico. Pertanto, è difficile garantire una riproducibile Killer-APC feno definitatipo che può essere utilizzato per la modulazione antigene-specifica delle risposte delle cellule T in vivo. Sulla base del nostro lavoro precedente con FasL esprimono Killer-APC 3-5 e cellule presentanti l&#39;antigene artificiali (AAPC 6,7) abbiamo sviluppato un approccio basato tallone-(KaAPC) per l&#39;inibizione antigene-specifica o l&#39;eliminazione di cellule auto-reattive T in vitro. KaAPC costituiti da un dimero HLA-A2-Ig (segnale 1) e un anti-Fas mAb (segnale inducendo apoptosi) covalentemente immobilizzato su una superficie di una perlina paramagnetico lattice 4,5 micron. Essi riducono cellule T antigene-specifiche in un Fas / FasL modo mediato da colture di cellule T di molteplici specificità in maniera antigene-specifica e indipendente l&#39;attivazione indotta morte cellulare (AICD) percorso. Dose dipendente apoptosi nelle cellule T bersaglio è indotta rapidamente già dopo 30 min 8. KaAPC può essere facilmente generata in modo controllato garantire un definito al largo della phenot scaffaleipo e superare la maggior parte delle carenze di strategie di deplezione delle cellule based. Di conseguenza, KaAPC visualizzare un grande potenziale per il trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate e rigetto, avanzando il campo di cellule T specifiche strategie di trattamento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

Attuale trattamento di cellule T malattie autoimmuni mediate si basa principalmente su strategie di immunosoppressione globale, che, a lungo termine, è accompagnato da effetti collaterali negativi, come una ridotta capacità di controllare le infezioni o tumori. Pertanto, nuovi approcci devono essere sviluppati che colpiscono le cellule solo la malattia di mediazione e lasciare il sistema immunitario rimasta intatta. Negli ultimi dieci anni una varietà di strategie di immunoterapia a base di cellule di modulare sono stati sviluppati cellulari mediata risposte immunitarie T. La maggior parte di questi approcci si basano su cellule presentanti l&#39;antigene-tolleranza indurre (APC). Tuttavia, oltre ad essere tecnicamente difficile e ingombrante, tali approcci basati su cellule sono molto sensibili alle risposte delle cellule T citotossici, che limita la loro capacità terapeutica. Qui vi presentiamo un protocollo per la generazione di cellule presentanti l&#39;antigene artificiali non cellulari killer (KaAPC), che consente la deplezione di cellule T patologiche lasciando la risistema immunitario rimanente intatta e funzionale. KaAPC è una soluzione alternativa per l&#39;immunoterapia cellulare che ha il potenziale per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico regolando indesiderati risposte delle cellule T in modo specifico antigene.

Le caratteristiche di questo protocollo includono la generazione delimitati di un fenotipo KaAPC che visualizza HLA-A2-Ig (segnale 1) e anti-Fas mAb (segnale di apoptosi) Allo stesso tempo, che in confronto a quelli fondati cellulari non è influenzata dal rivestimento o di efficacia di trasduzione e possono essere facilmente modulata durante la produzione (Figura 1). Inoltre, KaAPC, non sono sensibili alle funzioni effettrici citotossiche delle cellule T e la loro funzionalità non dipende dalla qualità delle cellule presentanti l&#39;antigene autologo pre e post manipolazione in vitro. KaAPC sono in grado di deplezione delle cellule T antigene-specifiche in vitro quando caricato con peptide cognate, mentre il non-cognate caricato KaAPC non deplezione delle cellule T (Figura 2). Pertanto, KaAPC induce l&#39;apoptosi delle cellule T in modo antigene-specifica. Successivamente, abbiamo utilizzato KaAPC per deplezione selettiva di cellule T antigene-specifiche da una miscela di differenti spe cellule Tcificities, dimostrando che solo citotossicità minimo perdeva in cellule T circostanti (Figura 3). Così, KaAPC rappresentano uno strumento raffinato per deplezione in vitro antigene-specifica delle cellule T antigene-specifiche umani attivati ​​con applicabilità potenziale clinico per il trattamento di malattie autoimmuni e rigetto allogenico.

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Orientamenti sono presentati per la generazione di antigene artificiale assassino cellule presentanti, KaAPC, uno strumento efficace per deplezione in vitro di cellule T antigene-specifiche umani e una soluzione alternativa per immunoterapia cellulare per il trattamento delle malattie autoimmuni mediate da cellule T in un antigene modo specifico senza compromettere il sistema immunitario rimanente.

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Views.  Johns Hopkins University.  Orientamenti sono presentati per la generazione di antigene artificiale assassino cellule presentanti, KaAPC, uno strumento efficace per deplezione in vitro di cellule T antigene-specifiche umani e una soluzione alternativa per immunoterapia cellulare per il trattamento delle malattie autoimmuni mediate da cellule T in un antigene modo specifico senza compromettere il sistema immunitario rimanente. 

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Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antigene specifico In Vivo Analisi Uccidere utilizzando cellule bersaglio CFSE etichetta

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Generazione<em&gt; De Novo</em&gt; Antigene-specifici T umana recettori cellulari di trasduzione retrovirale di Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

Quantificazione delle cellule CD4 specifiche dell'antigene umano che proliferano utilizzando Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Generazione ad alta efficienza di cellule T Topo primario specifico dell'antigene per test funzionali in un modello di diabete autoimmune

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...